结直肠侧向发育型肿瘤分子遗传学的研究进展

杨秋玉,何璇昱,白杨

【提要】 结直肠癌是目前全球恶性肿瘤死亡的主要病因，其发病率和死亡率均高居前位。侧向发育型肿瘤(LST)作为结直肠癌的癌前病变之一，具有独特的病变形态、生长方式和生物学行为，且癌变潜能较高，可在3年内发展成为结直肠癌，目前其具体分子机制尚不明确。LST发展和癌变过程是一个复杂过程，其中涉及原癌基因激活、抑癌基因失活、凋亡相关基因改变、错配修复基因异常等一系列的基因改变，本文就该过程中主要的异常分子变化做一概述。

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一，也是全球恶性肿瘤死亡的主要病因，其发病率和死亡率分别位于第四位和第二位[1]。早期结直肠肿瘤根据大体形态可分为隆起型、平坦型和凹陷型[2]。侧向发育型肿瘤(laterally spreading tumor，LST)是由日本学者工藤进英于1993年首次提及[3]的一种特殊形态的平坦型病变，具体定义为：直径>10 mm，沿肠黏膜表面侧向生长或环肠壁生长的一种特殊形态的大肠表浅型病变，较少向肠腔深部发生浸润。依据内镜下形态，LST可分为颗粒型(granular type，LST-G)和非颗粒型(non-granular type，LST-NG)两个亚型，其中颗粒型细分为颗粒均一型(homogenous type，LST-G-H)和结节混合型(nodular mixed type，LST-G-M)，非颗粒型又分成扁平隆起型(flat elevated type，LST-NG-F)和假凹陷型(pseudo-depressed type，LST-NG-PD)[4]。LST是内镜形态学诊断，其病理组织学大多是腺瘤和黏膜癌，相较于隆起型腺瘤，LST癌变时间明显缩短，动态追踪观察发现LST在3年内即可发展成为进展期结直肠癌[5]。结直肠癌的发生是一个多因素、多基因、多阶段的复杂过程[6]，由多种遗传学和表观遗传学改变累积而逐步发生的[7]。LST与结直肠癌的关系密切，其发展成癌的过程涉及到原癌基因激活、抑癌基因失活、凋亡相关基因改变、错配修复基因异常等一系列的基因改变，目前国内外学者已经做了一些相关基础研究。本文就目前发现LST在发展和癌变过程中主要的异常分子做一概述。

1 致癌途径

目前认为，结直肠癌的致癌途径包含了经典的腺瘤-癌途径、炎-癌途径、de novo途径以及锯齿状途径。其中最常见的癌变途径是经典的腺瘤-癌途径，约占结直肠癌的80%，通过染色体不稳定和基因突变的顺序累积引起腺瘤的发生和发展[8]。炎-癌途径发生比例少，约有1%的结直肠癌来源于炎症性肠病，特别是溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，一项队列研究的荟萃分析显示，从初次确诊为UC开始随访14年，发现UC患者发生结直肠癌的风险较正常人高出2.4倍[9]，这与炎症所引起的氧化应激和自由基的增加有关。还有一部分少见的结直肠癌的发生是直接从正常黏膜到癌变，即de novo癌[10]，它不经过腺瘤阶段，组织病理不含任何腺瘤成分，具有发病隐匿、病灶微小，但恶性程度和浸润转移能力极高的特点，这种特殊的生物学特性其机制尚未阐明。近些年来，越来越多的证据表明结直肠癌也可以通过锯齿状途径发展而来，最近的研究指出有15%～30%的结直肠癌是通过锯齿状前体病变发生的[11]。

LST是结直肠癌的癌前病变，与隆起型腺瘤相比，具有独特的病变形态和生长方式，关于它的发生发展较早期有研究认为颗粒型是由Ⅱa型的早期结直肠癌发展而来，向上生长则形成隆起型结肠癌，水平生长则发展成颗粒型LST[12]。Mukawa等[13]通过研究KRAS突变率以及环氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)和胃泌素过表达的频率，发现LST-G和隆起型结直肠肿瘤相似，认为LST-G具有与腺癌-癌序列类似的基因改变，这被认为是LST-G发展为结直肠癌的主要途径。另有研究认为一些伴有高级别上皮内瘤变的LST，可在中央凹陷区迅速向黏膜下浸润，大体形态通常是Ⅱa和Ⅱa+Ⅱc，尽管病变较小，这些LST被认为是通过de novo途径发展的[14]。还有研究显示在158例LST中存在10.8%病理证实为锯齿状腺瘤,推测部分LST可通过锯齿状途径进一步发展[15]。总之，由于LST的亚型较多，目前对于LST的致癌途径尚无统一观点，一般认为不同亚型的LST的癌变途径不同。

2 异常分子

2.1 原癌基因

2.1.1RAS基因RAS基因编码一组与G蛋白同源的小分子蛋白(RAS蛋白)。RAS蛋白作为传递细胞信号的开关，正常情况下，RAS蛋白可在无活性的GDP结合状态和有活性的GTP结合状态相互转化，具有GTP水解酶活性。RAS基因突变致使丧失GTP水解酶活性，激活下游信号通路，使细胞处于持续性增殖状态，从而导致癌变的发生。RAS基因包括HRAS、KRAS和NRAS三类。虽然这三种癌基因发生突变时都有使正常细胞发生转化的能力，但在结直肠癌中KRAS基因突变最为常见，其突变率为40%～54%[16]。Sugimoto等[2]检测隆起性腺瘤、LST-G和LST-NG三组中KRAS的突变率分别为30%、54.3%、21.1%，进一步通过多因素分析表明不同亚型的LST与KRAS突变率显著相关。Nakae等[17]研究发现，在近端结肠中LST-G的KRAS突变发生率(69%)明显高于LST-NG(6%)。Sakai等[18]检测LST-G的KRAS突变率(70%)明显高于LST-NG的KRAS突变率(26%)。国内学者刘一品[19]、钟选芳[20]报道的结果也与国外报道一致，提示在LST-G的发生发展过程中，KRAS参与的信号激活途径扮演着重要的角色，而LST-NG的发生发展可能存在于其他途径。

2.1.2β-catenin基因β-catenin基因能编码一种具有介导细胞黏附及信号转导双重活动性的多功能蛋白，即β-catenin蛋白，又称连环蛋白。在β-catenin蛋白结构中，肽链的N末端含有数个糖原合成激酶(glycogen synthase kinase，GSK)-3β的磷酸化位点，C末端含有活化相应靶基因转录的功能，中间核心区形成α螺旋和连接环结构，可与钙黏蛋白(Cadherin)、腺瘤性息肉病蛋白(adenomatous polyposis protein of colorectum，APC)及核内转录因子T细胞因子(T cell factor，TCF)结合，一方面形成与Cadherin形成复合体与细胞骨架相连，维持上皮细胞极性、粘附性等重要功能，另一方面β-catenin作为Wnt(wingless-type MMTV integration site family)信号通路的关键分子，在该通路上与TCF相互作用调节基因的转录[21]。已有较多研究证明β-catenin蛋白与结直肠癌的发生密切相关，且是结直肠癌发生的早期事件。Mikami等[22]发现有β-catenin在扁平型肿瘤的凹陷区表达高于非凹陷区，但这种差异无统计学意义。Hashimoto等[23]报道β-catenin在LST中处于高水平表达。另也有研究发现β-catenin在LST中表达较隆起性腺瘤明显升高[24]，这些研究均提示β-catenin高表达在LST中起重要作用。即使是在LST的亚型之间表达也有差异，Sugimoto等[2]发现β-catenin在LST-NG的表达较LST-G显著升高，Nakae等[17]的报道也得到一致结论，提示β-catenin在LST-NG的发生发展中扮演重要角色。

2.1.3C-myc基因C-myc基因是myc细胞癌基因家族的主要成员之一，编码由439个氨基酸组成的磷酸蛋白，即C-myc蛋白。C-myc在基因转录和细胞周期调节中具有“分子开关”作用，C-myc的表达通常受到生长因子和细胞外基质所接触到的环境调控。在静止期细胞中，C-myc基因的表达水平很低，几乎检测不到；一旦进入细胞周期G1期，C-myc mRNA和C-myc蛋白表达迅速增加并有一过性的剧增；随后，在增殖细胞中C-myc的表达下降并维持在基础表达水平[25]。研究表明约有70%的结直肠癌存在C-myc基因异常激活[26]。Shi等[27]通过比较20例隆起型腺瘤、20例LSTs、20例结直肠癌组织标本中的C-myc蛋白表达量，结果显示结直肠癌组的表达量明显高于LST组，隆起型腺瘤组最低，间接说明LST相较于隆起型腺瘤有更高的恶变潜能。

2.2 抑癌基因

2.2.1APC基因APC基因编码的蛋白质有多个功能区，在信号转导、细胞分裂、细胞粘附和家族性结肠息肉的癌变中起重要作用。APC蛋白是Wnt信号通路的组成部分。Wnt信号通路有两种不同途径：经典途径和非经典途径。APC蛋白是一种肿瘤抑制蛋白，在经典的Wnt信号通路中发挥功能[28]。研究表明其在大多数结直肠癌的早期癌变中发挥重要作用，认为APC基因是大肠黏膜上皮的“看门”基因，负责维护黏膜上皮细胞数量的自稳性，APC基因的失活突变导致Wnt信号通路过度激活，引起细胞增殖和腺瘤的失调发展[29]。国内学者张斌[30]研究显示，APC基因蛋白产物在大肠腺癌组中呈显著低表达，明显低于大肠腺瘤组、LST良性组和正常黏膜组，说明APC蛋白产物的失表达与大肠癌的发生有关。Sugimoto等[2]发现LST-NG组的APC突变频率(60%)明显高于LST-G组(28%)，提示参与LST-NG的Wnt信号通路中APC基因突变为主要因素。但是Sugai等[31]报道在LST-G中的APC的突变率明显高于LST-NG。而Sakai等[18]研究显示，APC基因突变率在LST-G和LST-NG中分别为88%和82%，均表现出APC高频率突变，差异无统计学意义，并且提示APC基因突变与LST的早期发展相关，可见APC基因在LST亚型中的作用尚未形成统一意见，还需将LST细分化并增加样本量进一步探究。

2.2.2p53基因p53基因作为最重要的抑癌基因之一，在细胞周期阻滞、细胞衰老、凋亡、分化及代谢过程中起着重要的作用，超过50%的人类肿瘤存在p53基因的突变[32]。p53基因编码产物为“基因组守护者”之称的转录因子p53蛋白，在细胞应激的情况下(如DNA损伤，缺氧、原癌基因激活等)，p53可诱导细胞周期停滞、凋亡或者衰老。p53基因突变后，编码的突变型p53蛋白不但失去了正常野生型p53蛋白的抑癌功能，而且还获得了一系列类似于癌基因表达产物的功能，从而增强了肿瘤细胞的活动、侵袭与转移能力，促进了肿瘤的发生、发展[33]。研究显示散发的结直肠癌中有40%～50%发生p53突变[32]。Nagai等[34]报道p53在LST-G的阳性率比LST-NG低，提示LST-G和LST-NG不同，后者更有类似于肿瘤的表型特征。Sakai等[18]通过多因素分析表明p53突变为LST恶变的独立危险因素，提示LST-NG恶性潜能可能高于LST-G，LST-NG更易发生黏膜下浸润。

2.3 错配修复基因

错配修复基因发生突变或启动子甲基化均可引起错配修复基因失活，机体错配修复功能的降低，造成基因组不稳定，导致某些癌基因和抑癌基因的突变，从而引起肿瘤的发生。研究表明DNA错配修复基因(常见的是MLH1和MSH2)的突变或甲基化导致的微卫星不稳定是结直肠癌发生的机制之一[35]。有研究认为在微卫星不稳定有关的大肠癌中，发现错配修复基因异常可能与CpG岛甲基化表型(CpG island methylator phenotype，CMIP)有关[36]，Hiraoka等[37]发现在>1 cm的腺瘤中，LST-G中CpG岛甲基化涉及2个或更多基因座(CpG岛高甲基化)的比例(61%)明显高于隆起型腺瘤(25%)。Konda等[38]研究显示，LST-G的CIMP的比例(32%)高于LST-NG(6%)。但也有研究比较LST、隆起型腺瘤和进展期结直肠癌的相关错配修复基因的CMIP甲基化情况，并无显著差异，提示错配基因的高甲基化是结直肠癌的共同早期事件，此外，该研究还显示APC的高甲基化状态与LST的黏膜下浸润呈负相关[39]。

2.4 修饰基因

环氧化酶(COX)是前列腺素合成初始步骤中的关键性限速酶，COX包含3种同工酶COX-1、COX-2和COX-3[40]。其中COX-2基因处于1号染色体，正常组织内通常不表达，在各种损伤性化学、物理和生物因子的刺激下迅速产生，因此COX-2也被称为诱生型环氧酶，进而催化前列腺素合成参与炎症反应[41]。许多遗传和生物学证据已经明确表明COX-2在结直肠肿瘤发生中起重要作用。在LST中的作用也被报道，较早的一篇研究报道LST中的COX-2的表达较隆起性肿瘤明显增加，推测COX-2蛋白可能在结直肠LST的肿瘤发生中起重要作用[42]。Mukawa等[13]通过检测LST中COX-2表达情况，发现在结直肠隆起性肿瘤、LST-G、LST-NG中过表达比例分别为73.1%、88.2%、31.6%，结直肠隆起性肿瘤和LST-G的过表达比例明显高于LST-NG，认为COX-2的异常表达可能参与了LST的发生发展。

2.5 凋亡相关基因

LST由于其具有沿黏膜水平生长的特点，认为可能与肿瘤细胞的异常增殖及凋亡有关。细胞凋亡受凋亡促进因子和凋亡抑制因子的共同调节。Survivin基因编码产生的蛋白由142个氨基酸组成，即Survivin蛋白，是近些年发现的一种肿瘤特异性凋亡抑制因子。Survivin蛋白的分子量在凋亡抑制蛋白家族中的一个重要成员，具有抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、调节细胞有丝分裂等功能，在大多数已分化的成熟组织内，Survivin表达量很低以至不能检测，但其在几乎所有肿瘤中却过表达，并与肿瘤的进展、肿瘤复发率的升高和总生存期的缩短有关。研究显示，在早期结直肠癌中Survivin表达上调可能参与了肿瘤进展[43]。关于Survivin在LST中发挥的作用，目前研究尚少。国内学者吴晓东[44]采用免疫组化的方法对比了LST、大肠腺瘤、大肠腺癌和正常组织中Survivin的表达，结果显示LST组和腺瘤组明显低于大肠腺癌组，推测从大肠正常组织到癌变的过程中Survivin的表达逐渐增加，并考虑Survivin过度表达是大肠癌发生的早期事件之一，即在腺瘤早期Survivin基因已被激活，表达出大量Survivin蛋白，抑制细胞凋亡，延长肿瘤细胞生存期，无论是水平生长还是垂直生长的大肠肿瘤都有其表达。

2.6 其他一些相关分子

除了上述提及的异常分子，还有一些其他分子也受到关注，如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-7、轴蛋白(Axin)、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1、Ki67、Cyclin D1等也在LST、结直肠癌和隆起型腺瘤的表达有不同程度的差异，较多集中在Wnt信号通路上的分子表达差异，推测其与LST的发生、发展有一定的联系。此外，还有一些分子被首次发现，如Nong等[45]首次报道GNAS基因在LST中突变率高，这种突变与LST位置(直肠)和病理类型(绒毛状)有关，GNAS是影响环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)生成的上游因子，因而推测突变的GNAS可能通过cAMP-COX2轴影响LST的发展。

3 结语

LST是特殊类型的结直肠肿瘤性病变，因其独特的病变形态和生长方式以及生物学行为，近二十余年受到国内外学者的广泛关注。LST在内镜下的表现不具有特异性，可仅出现黏膜褪色、发红等局限性色泽改变，早期容易漏诊[46]。随着内镜医生的重视和内镜检查技术的成熟，LST的诊断率明显增加。LST与结直肠癌密切相关，研究显示LST合并大肠癌的发生率从8.4%～52.5%不等[5]，然而，其发病机制尚不明确，因此找出其分子遗传学的诊断依据，探究其发病机制对于结直肠癌的发病机制有着重要意义。目前来看，对于LST的基础研究仍然较少，普遍认为不同亚型可能遵循不同的分子发生途径，对其分型大多采用颗粒型和非颗粒型，但LST存在四种亚型，关于这四种亚型的系统研究极少。本文概述了与LST发病和恶变相关的主要异常分子，希望对今后LST分子机制的研究有所帮助。将LST各个亚型细化并阐明异常分子间的相互调控关系，明确其发病机制是未来努力的目标。