过表达FOXN3对食管癌细胞生物学的影响

李军，胡涛，周东生，王青涛，魏冬

食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2%，全球每年约有30万人死于食管癌。中国是世界上食管癌的高发国家，也是世界上食管癌高死亡率的国家之一，平均每年病死约15万人[1]。叉头框蛋白家族(FOX)是一类DNA结合区具有翼状螺旋结构的转录因子，参与细胞周期进程的调控、胚胎的发育以及肿瘤的发生，在生物过程中发挥重要作用。近年来的研究发现，许多FOX蛋白与人类癌症有关，且可以作为药物靶标进行治疗[2]。叉头框蛋白N3(FOXN3)是FOX蛋白家族的一员，已有研究表明其在大多数恶性肿瘤中充当肿瘤抑制因子的角色[3]。例如FOXN3在骨肉瘤中下调并转录调节沉默信息调节因子6(SIRT6)抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭[4]。FOXN3过表达可能会抑制急性髓细胞白血病(AML)细胞系中的细胞增殖，诱导细胞周期S期停滞并促进OCI-AML3和THP-AML细胞凋亡[5]。而Wnt/β-catenin(β-连环蛋白)信号通路是最经典的致癌信号传导通路之一，该信号通路的过度激活通常会导致恶性肿瘤的发生，例如食管癌、肝癌、肺癌等[6]。目前，FOXN3在食管癌中的功能作用仍然未知，本研究通过探究FOXN3对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用，并进一步研究相关机制，为探讨食管癌新的治疗方法提供一定实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

RPMI 1640培养基、Lipofectamine 2000试剂(ThermoFisher公司)，10%胎牛血清(Hyclone公司)，食管癌细胞、食管上皮细胞HEEC(中国科学院上海生科院)，pcDNA3.1载体质粒、pcDNA3.1-FOXN3载体质粒(上海吉玛制药技术有限公司)，所有引物(广州锐博公司)，Cell Counting Kit-8试剂盒(CCK-8，同仁化学研究所)，V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(Sigma Aldrich公司)，PI-RNase A试剂(FuDunBio公司)，cleaved-Caspase-3兔单克隆抗体(ab32042)、Ki-67兔单克隆抗体(ab92742)、MMP-2兔单克隆抗体(ab92536)、Wnt1兔多克隆抗体(ab15251)、β-catenin兔单克隆抗体(ab32572)、GAPDH兔单克隆抗体(ab181602)，山羊抗兔IgG二抗(ab6721，上海Abcam公司)。

FACS细胞仪、CellQuest软件3.3版(BD Biosciences公司)，Transwell小室(上海生博生物公司)，培养箱(ThermoFisher公司)，化学发光成像仪(GENE GNOME)、酶联免疫检测仪(Thermo labsystem公司)，IX71倒置显微镜、CellSens Dimension软件(Olympus公司)。

1.2 RT-qPCR检测Eca-109、KYSE-30和TE-1的表达水平

使用Trizol试剂提取来自食管上皮细胞HEEC、食管癌细胞Eca-109、KYSE-30和TE-1的总RNA。按照反转录试剂盒将总RNA合成cDNA，然后进行RT-qPCR扩增。反应条件：预变性95 ℃ 10 min，变性95 ℃ 15 s，退火56 ℃ 60 s，72℃延伸2 min，共循环35次。以GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCt的方法进行相对定量分析。引物见表1。并选取FOXN3表达量最低的细胞进行后续的实验。

表1 Real-time PCR引物

1.3 细胞培养与转染

所有细胞均在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中，并在37 ℃ 5% CO2的培养箱中培养，3 d传代一次。将表达量最低的Eca-109细胞以2×105个/孔的密度接种到6孔组织培养板中，将细胞分为FOXN3过表达组、空载体对照组和对照组，其中对照组不做处理。用6 μg/mL的pcDNA3.1-FOXN3或pcDNA3.1转染Eca-109细胞转染，转染48 h后，将各组细胞转移至完全培养基继续培养，分别作为FOXN3过表达组和空载体对照组。收集对数期的细胞用于后续实验。

1.4 CCK8检测细胞增殖

将各组细胞悬浮液稀释至2×103个/mL，接种至96孔板(100 μL/孔)中。向每个孔中加入10 μL Cell Counting Kit-8溶液后，将板在培养箱中孵育1 h，并在450 nm处测量吸光度在24、48和72 h后用酶标仪读取。根据吸光度值绘制细胞增殖曲线。重复实验三次。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期

收集转染后各组细胞，用PBS洗涤两次，调整细胞浓度为1×106个/mL，重悬于500 μL结合缓冲液中。加入Annexin V-FITC和PI溶液在避光条件下25 ℃孵育15 min。PBS洗涤两次后，用FACS细胞仪检测细胞凋亡的速率。收集细胞，用PBS洗涤两次，在-20 ℃下用75%乙醇固定细胞1 h。PBS洗涤后置于PI-RNase A试剂中，在室温下避光孵育25 min，PBS洗涤后用流式细胞仪检测细胞周期，重复实验三次。用CellQuest软件进行分析。

1.6 Transwell检测各组细胞侵袭水平

将8 μm膜孔径12孔的Transwell小室放入培养板中，上室加入接种在200 μL无血清RPMI-1640培养基中浓度为5×104个/孔的各组细胞悬液，下室加入600 μL含10% FBS的RPMI-1640培养基。培养24 h，清除未穿透的细胞，并将剩余的细胞在95%乙醇中固定15 min，然后用0.1%结晶紫染色15 min。在倒置显微镜(×200)下成像，并计数细胞数。重复实验三次。

1.7 细胞划痕实验检测各组细胞迁移水平

在培养皿的背面划过5条直线，间隔为0.5～1.0 cm。在培养皿中加入2 mL浓度为2.5×105个/ mL的各组细胞，培养24 h。使用无菌10 μL移液器吸头垂直于五根基线进行一次刮擦。然后，用PBS洗涤细胞并添加2 mL无血清培养基以观察细胞。通过Olympus IX71倒置显微镜在0、24 h捕获划痕图像，用Olympus CellSens Dimension软件分析划痕的宽度。重复实验三次。

1.8 Western blot检测cleaved-Caspase-3、Ki-67、MMP-2、Wnt1和β-catenin蛋白表达

转染后各组细胞，用RIPA裂解并提取细胞总蛋白，加入5×上样缓冲液，沸水浴后分装保存蛋白质样品。通过SDS-PAGE(10%)分离蛋白质样品，并与相应的一抗[cleaved-Caspase-3 (1∶1 000)、Ki-67 (1∶5 000)、MMP-2 (1∶5 000)、Wnt1 (1∶1 000)、β-catenin (1∶5 000)、GAPDH (1∶10 000)]在4 ℃下孵育过夜。第2天室温复温并漂洗后加入山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)孵育，在化学发光成像仪内显影。重复实验三次。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 FOXN3在食管癌细胞中的表达

食管癌细胞Eca-109、KYSE-30、TE-1中FOXN3的相对表达量较食管上皮细胞HEEC显著下降(P<0.05)，其中Eca-109细胞FOXN3相对表达量最低，选取用于后续实验，见图1。

2.2 过表达FOXN3抑制Eca-109细胞增殖

与对照组和空载体对照组比较，FOXN3过表达组细胞增殖能力显著下降(P<0.05)，Ki-67蛋白相对表达量显著下降(P<0.05)，见图2。

2.3 过表达FOXN3促进Eca-109细胞凋亡

FOXN3过表达组细胞凋亡率较对照组和空载体对照组显著升高(P<0.05)，且过表达FOXN3后，Eca-109细胞G0/G1期比例显著升高，S期比例显著下降(P<0.05)，cleaved-Caspase-3蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)，见图3，提示过表达FOXN3阻滞Eca-109细胞周期，促进细胞凋亡。

图1 FOXN3在食管癌细胞中的表达 与食管上皮细胞HEEC比较，*P<0.05

图2 过表达FOXN3抑制Eca-109细胞增殖 A：三组细胞增殖趋势；B：三组细胞Ki-67蛋白表达。与对照组比较，*P<0.05；与空载体对照组比较，#P<0.05

图3 过表达FOXN3促进Eca-109细胞凋亡 A：三组细胞凋亡结果图；B：三组细胞细胞周期图；C：三组细胞cleaved-Caspase-3蛋白表达。与对照组比较，*P<0.05；与空载体对照组比较，#P<0.05

2.4 过表达FOXN3抑制Eca-109细胞侵袭和迁移

FOXN3过表达组细胞侵袭能力以及MMP-2蛋白相对表达水平较对照组和空载体对照组显著下降(P<0.05)，划痕宽度显著大于对照组和空载体对照组(P<0.05)，提示过表达FOXN3抑制Eca-109细胞侵袭和迁移，见图4。

2.5 过表达FOXN3抑制Wnt信号通路

与对照组和空载体对照组比较，FOXN3过表达组Wnt1和β-catenin蛋白相对表达量显著下降(P<0.05)，说明过表达FOXN3对Wnt信号通路起到抑制作用，见图5。

图4 过表达FOXN3抑制Eca-109细胞侵袭和迁移 A：三组细胞侵袭数目；B：三组细胞划痕宽度；C：三组细胞MMP-2蛋白表达。与对照组比较，*P<0.05；与空载体对照组比较，#P<0.05

图5 过表达FOXN3抑制Wnt信号通路 与对照组比较，*P<0.05；与空载体对照组比较，#P<0.05

3 讨论

食管癌是原发于食管的恶性肿瘤，主要表现为吞咽食物时哽咽感、异物感、胸骨后疼痛或明显的吞咽困难。多数患者在诊断时已是晚期，化疗过程中易出现耐药，尽管目前对食管癌患者的管理和治疗有所改善，但总的预后依旧很差，食管癌切除术后5年生存率约15%～40%，因此需要寻找有效的生物靶点[7-8]。FOXN3在许多器官中广泛表达，包括肝、胰腺、肾脏、肺和骨髓；在胚胎发育、组蛋白修饰、DNA损伤反应、细胞周期进程、新陈代谢中起着不可或缺的作用[9-11]。越来越多的研究表明，FOXN3是癌症的潜在治疗靶标，可以通过致癌活性调节肿瘤的发生。Sun等[12]发现，FOXN3在体外抑制人原发性肝癌(HCC)的增殖，在体内抑制HCC的肿瘤发生，提示FOXN3在HCC中起着抑癌作用。Li等[13]发现， FOXN3促进体外乳腺癌细胞的侵袭和上皮-间质转化(EMT)进程，以及体内乳腺癌的扩散和转移，表明FOXN3可能是乳腺癌的致癌基因。Chen等[14]发现，miR-611通过靶向FOXN3促进舌鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究发现，FOXN3在食管癌细胞中表达较低。而过表达FOXN3使食管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力减弱，且增殖相关蛋白Ki-67和侵袭相关蛋白MMP-2蛋白表达降低，而细胞凋亡相关蛋白cleaved-Caspase-3蛋白表达升高。表明FOXN3可能在食管癌中起肿瘤抑制作用。

Wnt/β-catenin信号通路涉及多种重要的细胞功能，并可通过调节癌细胞的增殖、凋亡和EMT过程促进肿瘤的发展和复发。β-catenin磷酸化被抑制可导致细胞内β-catenin积累和核易位，随后β-catenin作为转录共激活因子与T细胞因子(TCF)/淋巴增强因子(LEF1)转录因子复合，激活下游靶基因发挥功能[15-16]。在肿瘤发生过程中，Wnt/β-catenin信号通路的激活可以上调与细胞增殖和迁移有关的靶基因，例如c-myc和cyclin D1，从而促进细胞增殖和迁移，导致细胞癌变[17]。魏莉等[18]研究表明，敲减AT富集作用域2(ARID2)基因可促进Wnt/β-catenin信号通路活化，促进胰腺癌细胞生长和迁移。另外，FOXN3可以通过Wnt/β-catenin通路影响肿瘤细胞。Sun等[19]发现Wnt/β-catenin通路能通过抑制FOXN3表达，调节黑色素瘤的上皮-间质转化和转移，表明FOXN3与β-catenin相互作用，并可调节参与Wnt/β-catenin信号传导的蛋白质。Dai等[20]发现，结肠癌中FOXN3的丢失会激活β-catenin/TCF信号传导并促进癌细胞的生长和迁移。Zhao等[21]研究发现，FOXN3的过度表达抑制甲状腺乳头状癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭，并导致β-catenin、c-Myc和cyclin D1表达水平显著降低。另外，Wnt/β-catenin信号通路的激活逆转了FOXN3对甲状腺乳头状癌细胞的影响。上述研究均表明FOXN3对Wnt/β-catenin信号传导具有抑制作用。本研究发现，过表达FOXN3降低Wnt1和β-catenin的蛋白表达，抑制了细胞中Wnt/β-catenin通路的激活，从而抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促细胞凋亡。

综上所述，过表达FOXN3能够抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促细胞凋亡。这表明FOXN3在食管癌中发挥了抑制肿瘤活性的作用，可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路实现的。这些发现为潜在的治疗策略提供了新的治疗选择。