miR-133a-3p靶向调控VCP基因对人骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响

邓仲元，皮闻森，谭小青，贺星，杨树忠，郑甦

1 深圳市中西医结合医院，广东深圳518104；2 宜昌市中心人民医院；3 深圳市宝安区松岗人民医院

骨肉瘤是儿童和青少年时期最常见的原发性恶性骨肿瘤，具有恶性程度高、侵袭性强、易复发和转移等特点，预后较差。近年随着新辅助化疗广泛开展，骨肉瘤患者5年生存率已由单纯截肢术时的不足20%提高至60%～70%。尽管化疗和手术技术取得了很大进展，但仍有超过30%骨肉瘤患者最终死于该病[1]。目前，骨肉瘤的病因和发病机制尚不完全清楚。近年来，信号传导通路在骨肉瘤发生、发展中的作用受到诸多学者关注[2-4]。微小RNA(miRNA)是一类长度18～25个核苷酸的非编码小分子RNA，在信号传导通路中扮演重要角色。miRNA通过作用于靶基因3′非翻译区(3′UTR)，导致靶基因mRNA降解或抑制其翻译，从而参与调控靶基因表达。miR-133a-3p是当前研究较多的miRNA家族成员之一。有研究证实，miR-133a-3p能够参与鼻咽癌、乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤的发生、发展[5-8]。含缬酪肽蛋白(VCP)是一种泛表达蛋白，在多种细胞活动中具有类似分子伴侣的作用。有研究报道，VCP基因在骨肉瘤细胞中过表达，抑制VCP基因表达能够降低骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力。作者前期通过在线预测软件和双荧光素酶报告基因实验发现，miR-133a-3p可能通过直接调控VCP基因，参与骨肉瘤的恶性进展。2017年7月—2019年7月，本研究观察了miR-133a-3p靶向调控VCP基因对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS(以下分别称MG63、U2OS细胞)及人成骨细胞系hFOB1.19(以下称hFOB1.19细胞)，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。miR-133a-3p mimics、miRNA negative control(以下称miRNA NC)，购自上海吉玛制药技术有限公司。所有引物序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。VCP基因相关的双荧光素酶质粒(野生型WT、突变型MT)，购自美国Invitrogen公司。实时荧光定量PCR仪，购自西安天隆科技有限公司；多功能酶标仪，购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Transwell小室，由美国Promega公司提供。逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒及双荧光素酶活性检测试剂盒，购自北京艾然生物科技有限公司。

1.2 人骨肉瘤细胞和成骨细胞miR-133a-3p表达检测 采用RT-qPCR法。取MG63、U2OS细胞和hFOB1.19细胞各1×105个，接种于含15% FBS的DMEM完全培养液，置于细胞培养箱常规培养。待细胞融合70%～80%时，按1∶3传代。取传2代、对数生长期、生长状态良好细胞，TRIzol法提取细胞总RNA，经鉴定，提取的总RNA浓度、纯度和完整性合格，可用于后续实验。按逆转录试剂盒说明，将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行PCR扩增。引物序列为：miR-133a-3p上游引物5′-GATTATCCGATGACTCGTAG-3′，下游引物5′-AGTTGACATGATTATGCG-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。按照PCR扩增试剂盒说明配制反应体系。PCR反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 10 s共40个循环。收集各样本阈值循环数(CT)值。以U6为内参，以2-ΔΔCT计算目的基因相对表达量。选取miR-133a-3p相对表达量最低的骨肉瘤细胞进行后续实验。

1.3 miR-133a-3p过表达骨肉瘤细胞构建与鉴定 按上述方法传代培养骨肉瘤细胞，将传2代、对数生长期、生长状态良好的骨肉瘤细胞接种于96孔板，每孔5×105个。随机将骨肉瘤细胞分为观察组和对照组，每组设6个复孔。然后将96孔板置于细胞培养箱中常规培养，定期更换培养液。培养24 h，当细胞生长融合60%～70%时，观察组与对照组采用Lipofectamine3000瞬时转染技术，分别转染miR-133a-3p mimics、miRNA NC。转染24 h，将无血清培养基更换为完全培养基，继续转染24 h。收集细胞，按上述方法检测miR-133a-3p相对表达量。

1.4 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。收集两组上述转染48 h细胞，胰蛋白酶消化后制成密度为4×104个/mL的细胞悬液，按3×103个/孔接种于96孔板。然后将96孔板置于细胞培养箱中常规培养。分别于培养0、24、48、72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育1.5 h。采用多功能酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密度(OD)值。以OD450值代表细胞增殖能力。

1.5 细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验。收集两组上述转染48 h细胞，胰蛋白酶消化后制成密度为5×105个/mL的细胞悬液，以500 μL/孔接种于6孔板，孵育至单层细胞铺满培养皿底。用200 μL移液器枪头沿培养皿底部做“一”字形划痕，镜下观察并拍照记录。弃原培养液，更换为无血清的DMEM培养液，分别于继续培养24、36 h，镜下观察并拍照记录。根据公式计算细胞迁移率。细胞迁移率=(0 h划痕宽度-培养后划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.6 细胞侵袭能力检测 采用Transwell小室实验。收集两组上述转染48 h细胞，胰蛋白酶消化后制成密度为1×105个/mL的细胞悬液。将Transwell小室底部膜的上表面用基质胶覆膜并孵育过夜。次日，在无血清培养基的Transwell小室上室中加入制备的细胞悬液200 μL，下室加入含10% FBS的DMEM培养液600 μL。然后将Transwell小室置于细胞培养箱中常规培养。培养24 h，取出Transwell小室，轻轻拭去上室面基质胶和未穿膜细胞，经多聚甲醛固定、结晶紫染色，于倒置相差显微镜下计数穿膜细胞数。随机选取10个低倍不重叠视野(100×)进行计数。以穿膜细胞数代表细胞侵袭能力。

1.7 miR-133a-3p靶向调控VCP基因预测 借助生物信息学预测数据库TargetScanhuman7.2(http：//www.targetscan.org/)，确定miR-133a-3p和VCP的结合位点。

1.8 miR-133a-3p靶向调控VCP基因验证 采用双荧光素酶报告基因实验。根据突变位点分别设计野生型和突变型，以骨肉瘤细胞的cDNA为模板，通过PCR扩增分别获得野生型和突变型序列，连接到野生型VCP 3′UTR(psi-VCP-WT)和预测位点突变型VCP 3′UTR(psi-VCP-MT)。将骨肉瘤细胞接种于12孔板，随机分为psi-VCP-WT+miR-133a-3p mimics组、psi-VCP-WT+miRNA NC组、psi-VCP-MT+miR-133a-3p mimics组、psi-VCP-MT+miRNA NC组，于细胞培养箱中常规培养。当细胞生长融合至80%时，psi-VCP-WT+miR-133a-3p mimics组转染psi-VCP-WT和miR-133a-3p mimics，psi-VCP-WT+miRNA NC组转染psi-VCP-WT和miRNA NC；psi-VCP-MT+miR-133a-3p mimics组转染psi-VCP-MT和miR-133a-3p mimics，psi-VCP-MT+miRNA NC组转染psi-VCP-MT和miRNA NC。转染48 h，收集细胞，加入细胞裂解液充分裂解，离心留取上清液。按照双荧光素酶活性检测试剂盒说明检测各组荧光素酶活性。

1.9 VCP蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集两组上述转染48 h细胞，RIPA裂解液提取细胞总蛋白，加入上样缓冲液，经沸水浴使蛋白充分变性。取变性蛋白，SDS-PAGE分离蛋白。将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上，分别加入VCP、GAPDH蛋白一抗，4 ℃孵育过夜。次日，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃孵育30 min。发光液发光，暗室中曝光、显影。采用凝胶成像分析系统分析各蛋白电泳条带灰度值。以GAPDH为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值/内参蛋白电泳条带灰度值作为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 人骨肉瘤细胞MG63、U2OS和成骨细胞hFOB1.19 miR-133a-3p表达比较 MG63、U2OS细胞和hFOB1.19细胞miR-133a-3p相对表达量分别为0.57±0.17、0.28±0.14、1.09±0.18。MG63、U2OS细胞miR-133a-3p相对表达量均低于hFOB1.19细胞，且U2OS细胞miR-133a-3p相对表达量低于MG63细胞(P均<0.05)。

2.2 两组转染效率验证 观察组与对照组miR-133a-3p相对表达量分别为4.281±0.204、1.224±0.801，观察组miR-133a-3p相对表达量明显高于对照组(P<0.05)。

2.3 两组转染不同时间细胞增殖能力比较 见表1。

表1 两组转染不同时间细胞增殖能力比较

2.4 两组转染不同时间细胞迁移能力比较 见表2。

表2 两组转染不同时间细胞迁移能力比较

2.5 两组细胞侵袭能力比较 观察组穿膜细胞数为(79.2±10.4)个，对照组为(147.5±9.8)个，观察组穿膜细胞数明显低于对照组(P<0.05)。

2.6 miR-133a-3p靶向调控VCP基因预测结果 在TargetScanhuman7.2数据库中搜索VCP潜在的目标基因，结果发现miR-133a-3p在VCP基因3′UTR 77～83 bp处有且仅有1个保守结合位点。见图1。

图1 miR-133a-3p与VCP的结合位点示意图

2.7 各组荧光素酶活性比较 psi-VCP-WT+miR-133a-3p mimics组荧光素酶活性为0.418±0.042，psi-VCP-WT+miRNA NC组为0.968±0.023，psi-VCP-MT+miR-133a-3p mimics组为0.812±0.054，psi-VCP-MT+miRNA NC组为0.981±0.031。psi-VCP-WT+miR-133a-3p mimics组荧光素酶活性低于其他三组(P均<0.05)，而其他三组荧光素酶活性两两比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.8 两组VCP蛋白表达比较 观察组与对照组VCP蛋白相对表达量分别为1.324±0.023、3.231±0.031，观察组VCP蛋白相对表达量明显低于对照组(P<0.05)。

3 讨论

骨肉瘤是骨科常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，易发生肺部转移，预后较差。近年来，随着手术技术和放化疗水平不断提高，骨肉瘤患者预后得到明显改善，但其高复发率和高肺部转移率仍是患者死亡的主要原因[9-12]。目前，骨肉瘤侵袭和转移的机制尚不清楚。因此，进一步研究骨肉瘤侵袭和转移的分子调控机制，对寻找骨肉瘤潜在的治疗靶点具有重要意义。

信号传导通路中某些分子的基因经常发生突变，从而使活化的肿瘤干细胞异常增殖。近年来，信号传导通路在骨肉瘤发生、发展中的作用受到诸多学者关注[2-4]。自2002年CALIN等[13]首次报道miRNA失调与恶性肿瘤有关以来，大量研究证实miRNA失调能够参与恶性肿瘤的发生、发展。同样，miRNA失调在骨肉瘤的发生、发展中亦扮演重要角色。miR-133a-3p是当前研究较多的miRNA家族成员之一。有研究报道，上调miR-133a-3p表达能够明显抑制急性髓细胞性白血病、胰腺癌和肾癌细胞增殖活性[14-16]。为了证实miR-133a-3p与骨肉瘤的关系，本研究比较了MG63、U2OS细胞和hFOB1.19细胞miR-133a-3p的相对表达量，结果显示MG63、U2OS细胞miR-133a-3p相对表达量明显低于hFOB1.19细胞，并且U2OS细胞miR-133a-3p相对表达量低于MG63细胞，故选择U2OS细胞进行后续实验。采用瞬时转染技术转染U2OS细胞，结果发现，观察组miR-133a-3p相对表达量明显高于对照组，表明该技术能够明显上调miR-133a-3p表达。进一步研究发现，上调miR-133a-3p表达能够明显抑制U2OS细胞增殖、迁移和侵袭能力。证实miR-133a-3p能够参与骨肉瘤的发生、发展。但其具体作用机制尚不清楚。

VCP是一种泛表达蛋白，在多种细胞活动中具有类似分子伴侣的作用[17]，在内质网相关蛋白降解、核酸重建、细胞周期调控等过程中具有重要作用，具有抑制肿瘤细胞凋亡并促进其增殖、侵袭和迁移等作用[16]。研究表明，在恶性胶质瘤、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、恶性淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病等疾病中VCP基因异常表达，其异常表达与疾病病情进展和患者预后密切相关[18-20]。近年研究发现，VCP基因与骨肉瘤肺部转移有关，通过RNAi沉默VCP基因能有效抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭[18]。但目前对VCP基因的上游调控机制尚不清楚。本研究运用生物信息学预测数据库TargetScanhuman7.2确定miR-133a-3p与VCP的结合位点，结果发现miR-133a-3p在VCP基因3′UTR 77～83 bp处有且仅有1个保守结合位点，提示miR-133a-3p与VCP存在靶向关系。双荧光素酶报告基因实验显示，psi-VCP-WT+miR-133a-3p mimics组荧光素酶活性明显低于psi-VCP-WT+miRNA NC组、psi-VCP-MT+miR-133a-3p mimics组、psi-VCP-MT+miRNA NC组。而psi-VCP-WT+miRNA NC组、psi-VCP-MT+miR-133a-3p mimics组、psi-VCP-MT+miRNA NC组荧光素酶活性两两比较差异均无统计学意义。提示miR-133a-3p是VCP的下游靶分子。进一步研究发现，观察组VCP蛋白相对表达量低于对照组，提示过表达miR-133a-3p能够抑制VCP蛋白表达，即miR-133a-3p通过负向调控VCP基因，抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭。

综上所述，miR-133a-3p可能通过负向调控VCP基因，抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。这为探索骨肉瘤侵袭和转移的分子机制提供了依据，也为骨肉瘤防治提供了新的作用靶点。