人支气管上皮细胞地塞米松耐药与MUC1表达的关系

韩丽丽,李明娴,尹凤先,丁艳艳

1 首都医科大学大兴教学医院,北京102600;2 吉林大学第一医院

据统计，慢性阻塞性肺疾病(COPD)在全球死亡原因中居第四位，随着人口老龄化加剧和环境污染加重，其发病率仍在逐年上升[1-2]。目前，治疗COPD的药物以吸入性糖皮质激素为基础，地塞米松是其常用药物，但长期使用易产生耐药性[3]。迄今为止，COPD患者地塞米松耐药的机制尚不完全清楚[4]。黏蛋白1(MUC1)是一种Ⅰ型跨膜蛋白，能够介导气道上皮细胞的抗炎症反应。有研究报道，MUC1缺失能够加重COPD患者支气管上皮屏障破坏[5-6]。最近有研究发现，对皮质类固醇激素耐药的慢性鼻窦炎患者MUC1表达下调[7]。由此推测，MUC1有可能成为预测激素耐药的潜在生物标志物。但目前尚无直接证据表明COPD患者地塞米松耐药与MUC1表达缺失有关。2019年5月—2020年5月，本研究探讨了人支气管上皮细胞地塞米松耐药与MUC1表达的关系。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人正常支气管上皮细胞NHBE(以下称NHBE细胞)，购自美国ATCC细胞库。所有引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成。地塞米松，购自美国Sigma公司。Varioskan Flash多功能酶标仪，购自美国Thermo Fisher Scientific公司；CFX96 Touch实时荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司。IL-8、粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) ELISA检测试剂盒，购自武汉默沙克生物科技有限公司。

1.2 香烟烟雾提取物(CSE)制备 设计CSE装置，该装置由一大一小两个玻璃瓶经橡胶管连接而成。大玻璃瓶有两个开口，一个开口直通空气，另一个开口通过橡胶管连接于装有20 mL新鲜PBS的小玻璃瓶。小玻璃瓶通过橡胶管连接吸引器。在大玻璃瓶内点燃1支未去过滤嘴的香烟(红梅牌84 mm烤烟型香烟)，通过吸引器持续吸引，一共抽吸2支，抽吸时间5 min。将吸入的香烟烟雾通过橡胶管溶于20 mL PBS制成悬液，调整悬液pH为7.4，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即为100% CSE原液，其余浓度的CSE用PBS稀释制成10%、25%、50% CSE溶液，分装后冻存于-80 ℃冰箱。

1.3 细胞活力检测 采用MTT法。将NHBE细胞以2×103个/孔接种于96孔板，用200 μL含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。培养24 h，分别向96孔板中加入10%、25%、50%、100% CSE溶液20 μL，使CSE终浓度分别为1%、2.5%、5%、10%，另设阴性对照孔(不加入CSE)和空白对照孔(不加入NHBE细胞)。然后将96孔板置于恒温箱孵育48 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，恒温孵育4 h，弃上清，加入DMSO溶液150 μL，轻轻振荡混匀。酶标仪于570 nm波长处检测各孔的光密度(OD)值，计算细胞存活率。细胞存活率=(实验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

1.4 炎症因子IL-8、GM-CSF检测 将NHBE细胞接种于培养瓶中，用4 mL含10% FBS的DMEM培养基于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。培养24 h，分别加入10%、25%、50%、100% CSE溶液400 μL，使CSE终浓度分别为1%、2.5%、5%、10%。干预48 h，收集各浓度CSE干预后的培养上清液，置于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法检测培养上清液炎症因子IL-8、GM-CSF。检测仪器为Varioskan Flash多功能酶标仪，所有操作严格按IL-8、GM-CSF ELISA试剂盒说明进行。从1%、2.5%、5%、10% CSE中，选择引起NHBE细胞炎症因子分泌增加的最小浓度进行后续实验。

1.5 地塞米松耐药NHBE细胞构建 取NHBE细胞4×105个，接种于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的BEGM培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。培养24 h，加入1×10-7mol/L地塞米松200 μL，使地塞米松终浓度为1×10-8mol/L，每2～3天更换一次新鲜培养液。持续培养1个月，收集细胞，设为耐药细胞组，加入适量CSE溶液和地塞米松，使CSE终浓度达到上述筛选的最小浓度、地塞米松终浓度达到1×10-8mol/L。另取NHBE细胞，随机分为非耐药细胞1组和非耐药细胞2组，非耐药细胞1组加入适量CSE溶液，使CSE终浓度达到上述筛选的最小浓度；非耐药细胞2组加入适量地塞米松，使地塞米松终浓度达到1×10-8mol/L。各组干预48 h，收集培养上清液，采用ELISA法检测培养上清液炎症因子IL-8、GM-CSF。检测仪器为Varioskan Flash多功能酶标仪，所有操作严格按IL-8、GM-CSF ELISA试剂盒说明进行。

1.6 MUC1 mRNA表达检测 采用RT-qPCR法。取耐药细胞组、非耐药细胞1组和非耐药细胞2组干预48 h细胞，0.25%胰蛋白酶消化，PBS中和消化，用移液器轻轻吹打细胞，使细胞完全脱落。将细胞悬液收集于离心管中，1 500 r/min离心5 min、离心半径8 cm，收集细胞沉淀。采用TRIzol法提取细胞总RNA，经鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格，可用于后续实验。按cDNA合成试剂盒说明，将总RNA逆转录为cDNA。逆转录条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。将所得cDNA加入100 μL DEPC水稀释，按TB Green Premix Ex Taq Ⅱ说明进行PCR扩增。引物序列：MUC1上游引物5′-AATGAATGGCTCAAAACTTGG-3′，下游引物5′-CAGTAGGTTCTCACTCGCTCAG-3′；U6上游引物5′-TCGTCCTCATACTGCTCA-3′，下游引物5′-GAAACTACCTTCAACTCC-3′。PCR反应体系共25 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL；反应条件：37 ℃ 15 min循环3次，94 ℃ 5 s、55 ℃ 5 s、70 ℃ 5 s循环40次。以U6为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 不同浓度CSE干预后NHBE细胞活力比较 0、1%、2.5%、5%、10% CSE干预后，NHBE细胞存活率分别为(100.0±3.4)%、(98.5±3.0)%、(97.4±3.6)%、(95.2±3.1)%、(85.6±2.5)%。随着CSE浓度升高，NHBE细胞存活率逐渐降低，呈剂量依赖性(F=8.520，P<0.01)。5%、10% CSE干预后NHBE细胞存活率明显低于0、1%、2.5% CSE干预后，并且10% CSE干预后NHBE细胞存活率低于5% CSE干预后(P均<0.05)。而0、1%、2.5% CSE干预后NHBE细胞存活率两两比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.2 不同浓度CSE干预后NHBE细胞分泌炎症因子IL-8、GM-CSF水平比较 见表1。结果提示，引起炎症因子IL-8、GM-CSF水平增加的CSE最小浓度为5%，故选择5% CSE进行后续实验。

表1 不同浓度CSE干预后NHBE细胞分泌IL-8、GM-CS水平比较

2.3 地塞米松耐药NHBE细胞鉴定 各组炎症因子IL-8、GM-CSF水平比较见表2。结果提示，耐药细胞组地塞米松抑制NHBE细胞炎症因子IL-8、GM-CSF分泌的作用消失，表明地塞米松耐药NHBE细胞构建成功。

表2 各组炎症因子IL-8、GM-CSF水平比较

2.4 各组MUC1 mRNA表达比较 非耐药细胞1组、非耐药细胞2组、耐药细胞组干预48 h MUC1 mRNA相对表达量分别为40.5±5.7、39.2±4.7、15.6±3.1。耐药细胞组MUC1 mRNA相对表达量均低于非耐药细胞1组和非耐药细胞2组(t分别为15.201、14.305，P均<0.01)，而非耐药细胞1组与非耐药细胞2组MUC1 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(t=1.302，P>0.05)。

3 讨论

目前，治疗COPD的药物以吸入性糖皮质激素为基础，地塞米松是其常用药物。大部分COPD患者低剂量吸入地塞米松就能很好地控制症状，但部分患者需要更高剂量甚至口服才能达到最佳控制效果，表明这部分COPD患者对地塞米松的抗炎作用出现了抵抗。地塞米松耐药是COPD治疗过程中的常见问题，但目前对其耐药机制尚不完全清楚，可能与糖皮质激素受体磷酸化修饰改变、组蛋白脱氧酶2活性丧失等有关[4]。因此，深入探索地塞米松的耐药机制，对寻找其潜在的生物标志物或研发新的靶向药物具有重要意义[8]。

MUC1是一种Ⅰ型跨膜蛋白，广泛存在于呼吸道、胃肠道等上皮细胞以及各种免疫相关细胞表面[9]。以往MUC1通常作为一种肿瘤相关分子被研究，其在多数恶性肿瘤组织中过表达或异常糖基化[10]。有研究认为，MUC1、E-cadherin和PINCH三者相互作用共同影响非小细胞肺癌细胞间的黏附性并促进其恶性进展[11]。MUC1基因沉默可抑制肝癌细胞增殖和侵袭，其机制可能与调节细胞周期蛋白D1、c-Myc和MMP-9表达有关[12]。MUC1与卵巢癌组织病理分级和淋巴结转移有关[13]。在皮质类固醇激素疗效丧失的分子机制中，被分析最多的是磷脂酰肌醇3-激酶活化、组蛋白去乙酰化酶2活性丧失以及糖皮质激素受体对NF-κB的抑制作用等[4]，尚无证据表明其与MUC1表达变化有关。近年研究发现，MUC1是一种重要的内源性抗炎分子，在急性肺部感染中能够促进炎症消退[14]。但其具体作用机制尚不明确。

COPD的主要特征是肺部异常炎症反应，这种炎症持续存在通常与吸入有害气体或颗粒有关，而最常接触到的有害气体是香烟烟雾。香烟烟雾能够激活上皮细胞分泌炎症介质，如TNF-α、IL-1β、IL-6、GM-CSF和IL-8。本研究选择GM-CSF、IL-8这两种炎症因子。在研究过程中，首先制备CSE并刺激支气管上皮细胞，从而模拟COPD的炎症反应，根据CSE对NHBE细胞活力和对炎症因子GM-CSF、IL-8分泌的影响，确定以5% CSE进行后续实验。本研究结果显示，1×10-8mol/L地塞米松与5% CSE共同干预能够明显抑制NHBE细胞炎症因子GM-CSF、IL-8分泌，提示1×10-8mol/L地塞米松对炎症反应具有明显抑制作用。而1×10-8mol/L地塞米松持续干预NHBE细胞1个月，其抑制NHBE细胞炎症因子分泌的作用明显减弱，表明NHBE细胞对地塞米松已产生耐药性。进一步观察了NHBE细胞地塞米松耐药与MUC1表达的关系，结果发现，地塞米松耐药的NHBE细胞MUC1 mRNA相对表达量明显降低，由此推测NHBE细胞地塞米松耐药可能与MUC1表达降低有关。

综上所述，人支气管上皮细胞地塞米松耐药可能与MUC1表达降低有关。