T细胞免疫检查点封堵效应的生物标志物研究进展

王若峥, 范佩文

(1新疆医科大学附属肿瘤医院放疗中心， 乌鲁木齐 830011； 2新疆肿瘤学重点实验室， 乌鲁木齐 830011；13中国医学科学院肿瘤免疫与放疗研究重点实验室， 乌鲁木齐 830011)

近年来，免疫疗法作为肿瘤治疗的一大突破受到越来越多的关注。肿瘤细胞免疫逃逸的重要机制之一是T细胞表面免疫检查点受体(immune checkpoint receptor, ICR)表达的重编程[1]。ICRs是一类共刺激因子(CD27、CD28和CD137)和共抑制受体(如PD-1、CTLA-4、LAG-3等)，它们共同调节T细胞的反应质量。目前应用最广泛的免疫检查点阻断(immune checkpoint blockade, ICB)治疗策略是靶向PD-1/PD-L1和CTLA-4信号通路，以调节抗肿瘤免疫活性，并显示出一定的临床疗效[2]。

ICB对多种免疫原性强的恶性肿瘤有效。美国食品药物管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)已批准将ICB药物用于黑色素瘤，NSCLC，肾细胞癌，头颈部鳞状细胞癌，霍奇金淋巴瘤，尿路上皮癌，胃癌，宫颈癌等的临床治疗[3]。虽然相当一部分患者表现出客观的临床反应，但由于原发性或获得性耐药，大多数患者对ICB治疗反应不佳。迄今为止，治疗效果最差的是抗CTLA-4，约85%的患者无反应[4]，其次是抗PD-1，反应约40%[5]。联合治疗方案的反应率较高(约50%)，但毒性也较高[6]。因此，迫切需要预测ICB反应的生物标志物。

1 诱导抑制性免疫检查点(ICs)是肿瘤免疫逃逸的主要机制

免疫编辑假说概念化了肿瘤细胞在免疫压力下向肿瘤扩散和免疫监视逃逸的进化过程。有几个因素促成了这种免疫逃避。肿瘤微环境(TME)本身具有免疫抑制作用，可促进肿瘤细胞因子、趋化因子和抑制因子的进展[7]。例如，VEGFA可以上调CD8 + T细胞上PD-1的表达，而TGF-β增强PD-L1在肿瘤细胞中的表达[8-9]。此外，TME还可以招募免疫抑制免疫细胞，包括调节性T细胞、骨髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞等来逃避免疫清除。在免疫攻击的压力下，肿瘤细胞可通过减少基因表达或丢失突变等位基因来减少T细胞识别的新抗原的数量[10]。

在肿瘤发生和生长过程中发生的免疫抑制的主要机制之一是多种共抑制性受体(ICR)的上调，这些受体在肿瘤-基质界面以及基质本身内部产生一系列相互作用，导致阻断免疫攻击和T细胞耗竭。T细胞耗竭的关键标志是ICR的表达，导致效应功能丧失和无法转变为记忆T细胞池。T细胞耗竭在各种肿瘤中的重要性与慢性感染期间发生的耗竭相似。慢性抗原刺激可触发多种高水平抑制受体的共表达，包括PD-1、CTLA-4和T细胞免疫球蛋白和粘蛋白域-3 (TIM-3)等[11]。其中PD-1/PD-L1信号轴在免疫反应负调控中起主导作用，而CTLA-4与PD-1一样通过阻断T细胞激活的共刺激来建立免疫抑制相互作用，维持外周免疫耐受。鉴于PD-1 / PD-L1和CTLA-4途径在肿瘤免疫逃逸中的重要作用，抗PD-1 / PD-L1和抗CTLA-药物及其组合已成为当前主流的ICB肿瘤免疫疗法。

2 临床靶向ICR信号通路的机制

PD-1广泛表达于T淋巴细胞、B淋巴细胞、抗原呈递细胞、NK细胞、巨噬细胞等[12]。PD-1通常被认为是显性的抑制性ICR。与CTLA-4不同，PD-1信号通路的激活主要发生在适应性免疫抑制级联的效应阶段，阻断了细胞毒性T细胞清除癌细胞的能力。细胞毒性T淋巴细胞中PD-1与肿瘤细胞中PD-L1之间的相互作用通过多种机制降低了T细胞的活性，包括抑制T细胞受体下游信号传导、调节性T细胞的增强、B细胞的减少和自然杀伤细胞活性的降低[13-14]。PD-1与PD-L1的结合还阻断了CD28和T细胞受体(TCR)信号的激活以及T淋巴细胞和树突状细胞(DC)的接触[15-16]。在与肿瘤相关的巨噬细胞中，PD-1的高表达水平会导致巨噬细胞吞噬的减少。其配体PD-L1在肿瘤细胞上的表达导致Teff细胞溶解抗性，降低了颗粒酶A和穿孔蛋白的转录水平[17]。此外，PD-1信号通过稳定免疫突触形成，使CD4+和CD8+ T细胞在衰竭过程中丧失运动能力[18]。PD-1信号在肿瘤免疫中的相关性可以通过CD8+ T细胞中的PD-1表达作为晚期黑色素瘤和宫颈癌患者肿瘤反应性T细胞亚群的生物标志物得到证实[19-20]。 另一个重要的ICR是CTLA-4，它通过与共刺激受体CD28竞争来削弱T细胞的活化，导致IL-2，IL-4，TNF-α和IFN-γ的水平降低，以及CD8+和CD4+T细胞的增殖减少。与PD-1的广泛表达相反，CTLA-4主要在Treg细胞上表达并控制免疫自耐受和Treg诱导的免疫抑制[21]。CTLA-4通过排除DC与传统T细胞(Tconv)的Treg物理附着，抑制DC上CD86/80的表达并削弱抗原启动初始T细胞活化[22]。另外，在抗原暴露下，CTLA-4+CD4 +T细胞与DC的相互作用比CTLA-4-CD4+T细胞更短，从而导致IL-2水平和增殖降低[23]。此外，CTLA-4阻断可拯救TH1类CD4效应T细胞，并且可能与CD8 T细胞浸润和细胞溶解活性的增强以及记忆性T细胞的形成有关[24]。

3 候选ICB反应性生物标志物

尽管对免疫检查点的认识和特异性免疫检查点抑制剂的开发取得了重大进展，但许多免疫原性肿瘤患者对ICB不敏感，同时严重的不良反应和高昂的治疗成本也使得对ICB应答者的识别和生物标志物的研究成为迫切需要。将治疗前获得的静态生物标志物与用于监测和进一步临床分层的动态生物标志物相结合，有望纳入ICB治疗方案。目前，ICB的应答性生物标志物候选已在不同的生物学水平(细胞、蛋白质、转录本、基因)、不同的部位(肿瘤、外周血)，以及与免疫和肿瘤相关细胞群上被发现[25]，生物学相关的临床生物标志物可能有助于预测ICB反应。

3.1 遗传和表观遗传标志物在抗PD-1和抗CTLA-4单药治疗的背景下，多项研究探讨了NSCLC和黑色素瘤中整体肿瘤突变负荷/新抗原负荷与ICB反应之间的关系[26-28]。基因中的特定遗传突变，例如JAK1 / 2和BRCA1/2，可以预测ICB的临床疗效，这可能是由于未能激活IFN-γ靶基因和DNA修复机制缺陷的肿瘤中突变负荷增加所致[29-31]。JAK家族成员的功能丧失突变使黑素瘤对IFN-γ刺激具有抵抗力，而对IFN-γ触发的生长停滞不敏感[29]，并可能下调PD-L1表达，这是对PD-1封锁脱敏的可能机制[30]。DNA双链修复酶BRCA2中的突变导致突变负担急剧增加，导致对PD-1阻断的反应性增强[26]。此外，在对CTLA-4和PD-L1阻断有反应的黑色素瘤患者中，IFN-γ诱导的IDO表达增加[32]。此外，在对PD-1阻滞的应答者中观察到通过TCR的β链测序鉴定出的更高的TCR克隆性[33]。

越来越多的证据表明表观遗传标记在致癌作用中的重要作用[34-35]。真核生物常见的DNA甲基化类型为5-胞嘧啶甲基化(5mC)。而5mC在TET家族酶氧化后产生5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，5hmC被称为"第六种碱基"，可以调控基因表达，是一种重要的表观遗传修饰。研究表明5mC对于调节T细胞增殖并维持细胞毒性和辅助T细胞的分化至关重要，在抗原呈递后5hmC沉积在关键免疫基因中对T淋巴细胞的活化和分化具有特定作用，而5hmC的变化比5mC的变化更动态[36]。例如肝癌细胞显示出特定的甲基化和羟甲基化组谱，表明这些表观遗传标记有可能用作诊断或预后生物标记[37]。

3.2 转录生物标志物转录特征也可以提供对PD-1阻断反应的信息，尤其是当DNA突变特征和免疫学特征相似时。ICB后与临床结果相关的其他特征引入了新的假定的耐药机制，例如层粘连蛋白等细胞外基质成分的作用，这可能会形成屏障，使免疫细胞无法穿透肿瘤从而削弱免疫疗法[38]。另外，内源性逆转录病毒(ERV)RNA的表达与抗CTLA-4和PD-L1治疗的临床反应相关[39]。

3.3 组织病理学生物标志物在蛋白质水平上，组织病理学生物标志物包括PD-L1表达，PD-L1表达是黑色素瘤，NSCLC，肾细胞癌(RCC)和膀胱癌背景下抗PD-1和PD-L1单药治疗期间的生物标志物候选物[40]。迄今为止，PD-L1是FDA批准的唯一药物ICB生物标志物，用于pembrolizumab(抗PD-1)治疗NSCLC，胃或胃食管交界处腺癌，宫颈癌和尿路上皮癌。

3.4 细胞生物标志物肿瘤内的免疫细胞全景图区分了CTLA-4和PD-1阻断的临床反应和耐药性。一方面，在肿瘤浸润的CD8+ T细胞中，PD-1+CTLA4+T细胞中CD8+ T细胞的特定群体的存在与无进展生存(PFS)相关。这些细胞代表肿瘤相关的T细胞具有部分耗竭表型，它们更容易通过阻断共抑制受体的相互作用而恢复活力。另一方面，单纯挽救CD8+ T细胞不一定与临床反应相关。然而，当涉及到肿瘤负荷时，循环中的复活的PD-1+Ki67+CD8+ T细胞比单独的复活细胞计数更能预测PD-1阻断后的PFS[41]。此外，CD8+ T细胞和Treg细胞的比例与CTLA-4阻断的黑色素瘤的肿瘤坏死呈线性相关[42]。

3.5 液体活检生物标志物循环成分在识别反应性生物标志物方面有很大的潜力，可以在体液中进行非侵入性和动态的检测。到目前为止，循环游离DNA (cfDNA)的检测为多种肿瘤治疗策略提供了临床指导[43]。cfDNA中发现的突变是肿瘤活检的可靠替代物，治疗后cfDNA水平的升高可能与黑色素瘤患者的进展性疾病有关。cfDNA水平在其临床表现之前就能提供反应信息，并能预测ICB治疗的黑色素瘤患者的肿瘤负荷[44]。cfDNA中定量的拷贝数不稳定性可以预测疾病的进展，在免疫治疗不同肿瘤的患者中，其总体准确性优于单独的cfDNA浓度[45]。

最近的几项研究也表明，循环肿瘤细胞(CTCs)的检测和定量可以被认为是ICB中一个有前途的候选循环生物标志物。最近发表的一份病例报告将外周血中CTCs的检测与转移过程联系起来，PD-L1在晚期头颈癌患者的CTCs中高表达，提示PD-L1+ CTCs可以作为预测ICB反应的生物标志物[46]。属于ICR途径的蛋白也在液体活检中被检测到，并与反应相关ICB治疗前可溶性PD-L1水平较高的患者更容易进展，治疗后PD-L1水平的升高与ICB的部分应答相关[47]。共抑制性T细胞免疫球蛋白粘蛋白3 (TIM3)、PD-1、IL-15与CTLA-4阻断后较长生存期呈负相关，其中IL-15增加了TIM3、PD-1的表达[48]。

4 展望

免疫检查点封堵治疗通过与共抑制性免疫受体竞争的抗体重新激活抗肿瘤免疫反应，是肿瘤免疫编辑和逃避免疫监测的致命弱点，在临床应用中也显示出一定疗效。然而，由于缺乏良好的反应性生物标志物和影响ICB疗效的TME相互作用的复杂网络，很大一部分患者出现了先天性和获得性耐药，一些患者甚至出现了进展性耐药。正如我们在这篇综述中所描述的那样，许多研究都致力于寻找识别能够预测ICB反应的生物标志物。因此，使用新的方法以发现新的肿瘤内在和外在的机制，并寻找可靠有效的ICB疗效生物标志物，为免疫检查点抑制剂治疗疗效的提高，毒性反应的降低，从而为进一步提供个性化肿瘤免疫治疗策略具有重要意义。