肾脏常温机械灌注保存的研究进展与展望

王南南，邓旭，史源，陈立明，屈波（. 锦州医科大学武警后勤学院附属医院研究生培养基地，天津 006；. 天津市第一中心医院器官移植中心，天津 009； . 武警后勤学院附属医院肿瘤外科，天津 006）

早在1935 年Carrel 等［1］就探索了肾脏常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）保存技术，由于技术复杂以及静态低温保存（static cold storage，SCS）技术在供肾保存方面的成功，NMP 技术一直未得到充分的关注。近年来由于边缘供体肾脏应用的增加，SCS 已不能达到满意的保存效果，主要表现为原发性无功能（primary nonfunction，PNF）和移植物功能延迟恢复（delayed graft function，DGF）发生率的增加，加之心肺旁路外科设备与技术的发展，NMP 保存供肾再次成为肾移植领域研究的热点［2］。就保持供肾正常生理状态、提供能量代谢底物、支持主动修复所需的合成功能、清除毒性产物和评估供肾质量等方面而言，相对于低温保存技术，采用NMP 保存供肾具有巨大的潜在优势［3］。尽管NMP 在供肾保存中具有诸多优势，但最佳NMP 条件仍不明确，现就NMP 灌注液、灌注压力、灌注时间/时机、灌注温度与氧气浓度等方面的研究进展进行综述。

1 灌注液

1.1 人工灌注液：全氟化碳是一种具有携氧能力的惰性溶液，1994 年，Brasile 等［4］就以全氟化碳乳液为基础开发出了可用于NMP 的非细胞组分灌注液，他们在犬肾自体移植模型上证明了以全氟化碳乳液为基础的灌注液用于NMP 的可行性及安全性。2002 年与2010 年Brasile 等［5-6］在心脏死亡器官捐献（donation after cardiac death，DCD）供肾自体移植犬模型上再次证明该灌注液用于NMP 的可行性、有效性及安全性。第一代全氟化碳液相对不稳定，具有可变的半衰期、不能进行灭菌及注入体内后会引起诸多不良反应等缺点，而第二代、第三代全氟化碳液制造复杂、费用昂贵，限制了其在临床的应用［7］。

1984 年Daniels 等［8］开发了一种以无基质血红蛋白为基础的灌注液，研究发现该灌注液在肾脏NMP 保存中的作用有限，且会对肾脏造成毒性效应。2000 年Stubenitsky 等［9］将一种更加稳定的吡哆酸结合血红蛋白聚乙烯液用于NMP，比较了两种不同供肾保存策略（SCS +简短NMP 组比单纯SCS 组）对肾移植预后的影响，结果显示，与单纯SCS 组相比， 移植后SCS +简短NMP 组生存率明显升高（90%比73%），24 h 内血清肌酐水平与血清肌酐峰值明显降低。

2009 年Gage 等［10］研 究发 现：与UW 液 相比，在室温下采用Lifor 液（一种含营养素、生长因子和非蛋白携氧物质的人造灌注液）机械灌注猪DCD 供肾具有更高的肾血流量和更低的肾内阻力，该研究没有报道关于肾脏预后的信息，然而，较高的灌注流量在一定程度上意味着细胞结构得到了更好的保存。该研究中整个机械灌注期间灌注装置温度始终低于25℃，因此Lifor 液是否适用于NMP仍有待进一步研究。除上述人造灌注液外，有可能成为NMP 灌注液的携氧物质还有AQIX-RS-I、HemarinaM101 等［11-13］。

1.2 含血灌注液：与人造灌注液相比，含血灌注液可为供肾提供一个更加接近生理状态的环境，早期认为含血灌注液具有溶血、血小板激活、红细胞携氧能力退化、高肾内阻力以及组织水肿等诸多缺点，近年来随着心肺旁路外科设备与技术的发展，上述局限性明显改善［14］。2008 年，Bagul 等［15］报道将含洗涤红细胞的灌注液用于NMP 保存SCS 后的DCD 猪肾，他们在灌注液中添加了晶体液、抗菌药物、抗氧化剂和血管扩张剂以增加肾脏血流并保护肾脏，结果显示该NMP 系统可恢复耗竭的三磷酸腺苷水平，逆转部分SCS 损伤。 2011 年，Hosgood 等［16］首次报道将含压积红的灌注液用于临床供肾的NMP 保存，2013 年Nicholson等［17］首次报道将含血灌注液用于NMP 的临床研究，该研究比较了两种不同保存策略（SCS +简短NMP 组比单纯SCS 组）对扩大标准供肾保存效果的影响，结果显示，与单纯SCS 组相比，SCS +简短NMP 组的DGF 发生率明显降低（5.6%比36%）。 2017 年Urcuyo 等［18］欲采用3 种不同条件（体温全血、体温含全血Steen 液、21℃单纯Steen 液）分别机械灌注DCD 猪肾24 h，然而体温全血组由于肾内阻力快速增高而早期终止了灌注，结果显示，体温全血组肾小球和肾小管明显坏死，体温含全血Steen 液组出现了明显的酸中毒、高血钾及肾小球和肾小管坏死，仅21℃单纯Steen 液组呈现出可接受的肾内阻力与组织学结果。

近年来研究表明白细胞在缺血/再灌注损伤中具有重要作用，与全血相比，在NMP 中采用以去白细胞全血为基础的灌注液可抑制渗出、炎症反应及凋亡相关介质的释放，改善循环和肾脏功能，降低损伤的可能性［19-20］。近年来研究多将去白红细胞或洗涤红细胞悬浮于晶体液或者Steen 液中作为灌注液，保存效果较为理想［21-25］。

2 灌注压力

平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）是NMP 的一项重要变量，然而最佳MAP 尚无定论。2014 年Patel 等［26］在猪DCD 供肾再灌注模型上探索了NMP 灌注压对供肾保存效果的影响，肾脏进行23 h SCS 后以55 mmHg（1 mmHg ＝0.133 kPa）或者75 mmHg 的MAP 进行1 h NMP，然后两组肾脏均以85 mmHg 的MAP 进行3 h 自体全血常温再灌注以评估肾脏质量。NMP 期间75 mmHg 组肾脏血流量、氧气消耗量与尿量均明显高于55 mmHg组，体外再灌注期间75 mmHg 组尿液中内皮素-1 水平明显低于55 mmHg 组，与55 mmHg 组相比，体外再灌注后75 mmHg 组肾小管损伤严重程度明显改善。他们认为：与55 mmHg 相比，以 75 mmHg 的MAP 进行NMP 可减轻肾小管和内皮损伤。

3 时间/时机

根据NMP 应用时间/时机的不同，可将目前的NMP 临床前研究与临床研究分为3 种主要类型：SCS +简短NMP + SCS、SCS + NMP、持续NMP。其中SCS + NMP 又可根据NMP 持续时间的不同分为3 种类型：SCS +简短NMP、SCS +中等时间NMP、SCS +延长时间NMP。

早期肾脏保存的目标是延长保存时间为交叉配型以及抗体筛查争取时间。1980 年，van der Wijk等［27］采用低温保存技术与NMP 技术相结合的方法成功保存犬肾144 h，他们采取的保存策略为：SCS +简短NMP + SCS。随后Rijkmans 等［28］采用低温机械灌注+简短NMP+低温机械灌注的保存策略成功保存犬肾6 d，该研究表明：NMP 可预防低温保存引起的不可逆损伤，NMP 对供肾尤其是肾小管的保存是有利的。与人或者猪相比，犬肾可耐受大量缺血损伤，这些早期研究的临床适用性有待进一步研究。2014 年，Hosgood 等［29］报道1 例人类供肾经过10 h 29 min SCS + 1 h NMP + 5 h 21 min SCS 后被成功移植的案例，移植后供肾功能良好，没有任何并发症。

2000 年Stubenitsky 等［9］在DCD 供肾自体移植犬模型上比较了两种不同保存策略（24 h SCS 比 24 h SCS + 3 h NMP）对供肾移植预后的影响，结果显示，与单纯SCS 组相比，SCS + NMP 组再灌注损伤明显减轻，DGF 与PNF 的发生率均明显降低。Hosgood 等［30］在猪DCD 供肾模型上研究发现：体外再灌注前进行简短NMP 可恢复供肾ATP 水平，逆转部分SCS 产生的损伤；与单纯SCS 相比，体外再灌注前进行简短NMP 可改善肾脏的代谢功能，减轻输尿管损伤；低温机械灌注+简短NMP的保存策略是可行的，移植后未见技术相关性并发症，与单纯HMP 组相比，HMP+简短NMP 组肾脏功能改善［15，30-31］。2011 年与2013 年，Hosgood 等［16］在临床上再次证明SCS +简短NMP 策略保存供肾的可行性、有效性与安全性［16-17］。

2016 年Kaths 等［21］在猪肾自体异位移植模型上比较了两种不同保存策略（8 h SCS 比8 h NMP）对肾移植预后的影响，结果显示，移植后第10 天NMP 组血清肌酐水平和尿素氮水平与移植前基础水平相当，SCS 组肾功能参数明显劣于移植前基础水平。2017 年Kaths 等［24］在DCD 供肾自体异位移植猪模型上再次探索了上述两种保存策略对肾移植预后的影响，结果显示：移植后1 周内NMP 组血清肌酐值与肌酐峰值水平明显低于SCS 组，移植后第4 天NMP 组肌酐清除率明显高于SCS 组。他们认为：持续NMP 保存策略可改善DCD 供肾的功能，NMP 可能有助于扩大供体池，降低移植后DGF 发生率。同年，史源等［32］在DCD 供肾自体异位移植猪模型上比较了两种不同保存策略（8 h SCS 比8 h NMP）对供肾保存效果的影响，结果显示，移植后持续NMP 组供肾功能优于SCS 组。

2016 年与2017 年Kaths 等［23，25］在DCD 供肾自体移植猪模型上研究发现：SCS 后中等时间或者延长时间NMP 优于简短NMP，SCS 后简短NMP的获益有限，持续NMP 优于单纯SCS 或者SCS + NMP；仍需进一步探索NMP 的最佳灌注时间/ 时机以设计合适的临床研究，采用持续NMP 替代SCS 以消除/最小化SCS 损伤可能是未来的方向。

4 温度与氧气

4.1 温度：温度是机械灌注的一项关键参数，直接影响着机械灌注对供肾的保存效果。Adams 等［33］在DCD 供肾猪模型上探索了SCS +简短NMP 策略中温度对供肾保存效果的影响，结果表明：与32℃组相比，37℃组的肾小管和肾脏功能得到了更好的保存。NMP 关于温度的另一个问题是如何最佳地复温供肾，2015 年Schopp 等［34］提出了控制性氧合性复温（controlled oxygenated rewarming， COR）的概念，他们在DCD 供肾体外再灌注猪模型上比较了3 种不同保存策略（18 h HMP 比18 h SCS + 3 h HMP 比18 h SCS + 3 h COR）对供肾保存效果的影响，结果显示，与单纯HMP 组与SCS + HMP 组相比，保存后再灌注期间COR 组肌酐和尿素清除率明显升高，线粒体内稳态失衡状态明显改善，氧气消耗量明显增加，肾组织NAD 水平明显升高，caspase-9 激活诱导的线粒体途径凋亡明显减轻。Minor 等［35］在猪肾体外再灌注模型上探索了SCS 后COR（18 h SCS 比18 h SCS + 90 min COR）对供肾保存效果的影响，结果表明，与单纯SCS 组相比，体外再灌注期间SCS + COR 组肾脏功能明显改善。

4.2 氧气浓度：Nicholson 等与Kaths 等［23，25］所实施的NMP 相关研究均采用经CO2平衡的高浓度氧气作为灌注气体以确保充分的氧合并维持酸碱平 衡［15，30-31，36］。然而高氧环境可能会促进活性氧的产生，诱发氧化性损伤，Kron 等［37］在大鼠模型上研究发现NMP 保存供肾期间高氧环境诱发了较强的氧化应激损伤。Hameed 等［38］在猪DCD 供肾模型上研究发现采用经CO2平衡的氧气作为简短NMP 气体对供肾的保存效果优于纯氧。

5 展 望

与低温技术相比，NMP 具有诸多优势，已有大量临床前研究证明其在肾脏保存方面的可行性、安全性及有效性，虽然NMP 在临床实践中的应用仍处于初级阶段，但初步结果是积极的。就技术本身而言，NMP 仍未发展成熟，最佳的灌注条件 （例如灌注液、时间/时机、灌注压力、温度与氧气浓度等）尚无定论。就成本-效益而言，如果NMP 能够确保捐献池供体的利用率增加或降低器官废弃率，NMP 具有巨大的潜在性经济效益。就临床用途而言，NMP 不仅可改善供肾的保存效果，还可为移植前供肾的体外修复/治疗、供体质量评估提供机会，这将增加可用于移植的供肾数量并减少不必要的供肾废弃。随着上述问题的逐渐阐明，更多的肾脏将被最佳化保存并被成功移植。