依达拉奉对氧诱导视网膜病变乳鼠的作用及其机制研究*

姚东伟，田川，胡东瑞，曹瑾，杨路，张萍

（1.宁波市第一医院 眼科，浙江 宁波315012；2.宁波大学医学院附属医院 眼科，浙江 宁波 315000）

早产儿视网膜病变是一种复杂的多因素疾病，主要病理特征为早期视网膜血管闭塞导致大量异常新生血管形成，容易发生出血、渗出等，严重者可引起视网膜脱离，视力丧失[1]。随着医疗水平的提高，越来越多的早产儿得到成功救治，新生儿存活率显著提高，但早产儿视网膜病变发病人数却随之增加。早产儿视网膜病变发病机制复杂，其中给氧治疗与早产儿视网膜病变关系密切。研究发现，吸氧过程中存在氧自由基损伤，其在早产儿视网膜病变发病机制中发挥重要作用[2]。高氧可诱导未发育成熟的视网膜血管收缩，甚至闭塞，视网膜组织氧含量相对降低，引起一些血管生长因子分泌，促进新生血管形成，从而诱导早产儿视网膜病变[3]。依达拉奉为神经保护药物，同时也是一种强效的抗氧化剂，具有较强的氧自由基清除能力，可以保护组织免受氧化应激损伤[4-5]，如依达拉奉可通过清除氧自由基减轻阿尔茨海默病患者的神经损伤[6]，提高急性脑梗死的治疗效果[7]。依达拉奉对糖尿病视网膜病变中具有保护作用，可通过提高抗氧化成分活性，加速自由基清除，减轻视网膜氧化应激损伤，从而发挥对视网膜的保护作用[8]，但其在早产儿视网膜病变中的作用尚不清楚。本文通过复制早产儿视网膜病变动物模型，研究依达拉奉对氧诱导视网膜病变乳鼠的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF 级、7日龄C57BL/6 乳鼠购自上海斯莱克有限公司，动物许可证号：SCXK（苏）2018-0003。将60 只乳鼠根据随机数字表法分为正常对照组、高氧诱导组和药物治疗组，每组20 只。

1.2 主要试剂和仪器

依达拉奉（淮南市国药集团国瑞药业，批号1709134），伊红、苏木精（美国Sigma 公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活力检测试剂盒和丙二醛（malondialdehyde, MDA）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）酶（上海生工生物工程股份有限公司），兔抗鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）单克隆抗体和兔抗鼠CD34 单克隆抗体（美国Abcam 公司），DAB 显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），BX43 型显微镜（日本Olympus 公司）。

1.3 动物模型的复制

高氧诱导组和药物治疗组乳鼠在高氧仓（自制）中生活5 d（出生第7 ～11 天），期间由原母鼠和1 只替换母鼠间隔12 h 交替哺乳。高氧仓氧流量控制在1.5 L/min，使仓内氧浓度在75%左右，温度控制在21℃左右，氧分压为常压，采用测氧仪测定仓内氧浓度4 ～6 次/d；每天定时进行加食、换水、更换垫料。正常对照组乳鼠在正常空气中饲养。5 d 后（出生第12 天起），将高氧诱导组和药物治疗组乳鼠从高氧仓中取出，放到正常空气中饲养。药物治疗组给予依达拉奉3 mg/kg，用生理盐水稀释后静脉注射；高氧诱导组和正常对照组乳鼠给予等量生理盐水静脉注射。用药至出生第16 天，每天测量乳鼠体重，出生第17 天进行取材检测。

1.4 取材

各组选10 只乳鼠，取出其右眼球，4%甲醛固定，用于苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色；取左眼球，剥离视网膜，用于生化检测。各组取5 只乳鼠，取眼球，4%甲醛固定，用于ADP 酶染色；取各组剩余5 只乳鼠视网膜用于检测VEGF 表达。

1.5 视网膜SOD 活力和MDA 含量检测

将乳鼠视网膜组织匀浆，3 000 r/min 离心10 min，取上清液，采用黄嘌呤法测定视网膜SOD 活力和MDA 含量。

1.6 视网膜HE 染色

将各组乳鼠视网膜组织用甲醛固定3 ～5 d，梯度酒精脱水，二甲苯透明，经浸蜡、石蜡包埋，切成4μm 厚切片，烤片6 ～12 h。梯度酒精脱蜡复水，切片苏木精染色5 min，自来水返蓝，再伊红染色3 ～5 min，自来水冲洗，经脱水、透明、封固。显微镜下观察，细胞浆呈粉红色，细胞核呈蓝色。

1.7 视网膜ADP 染色

将各组乳鼠视网膜用0.05 mol/L Tris-顺丁烯二酸缓冲液冲洗。配置反应液：0.2 mol/L Tris-顺丁烯二酸缓冲液+硝酸铅3.0 mmol/L+氯化镁6.0 mmol/L+ADP 粉末1 g/L。将视网膜置入配置的反应液中孵育15 min，Tris-顺丁烯二酸缓冲液冲洗，加入1 ∶10 稀释的硫化铵染色5 min，可见棕色沉淀，Tris-顺丁烯二酸缓冲液冲洗，50%甘油-PBS 封片，显微镜下观察并拍照。采用Image-ProPlus 测量高氧诱导组和药物治疗组乳鼠视网膜无灌注区面积。

1.8 免疫组织化学染色检测视网膜中VEGF、CD34 的表达

将视网膜石蜡包块经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，过氧化氢孵育15 min，阻断、灭活内源性过氧化物酶，枸橼酸缓冲液水煮10 min 修复抗原，加入一抗（兔抗鼠VEGF 单克隆抗体、兔抗鼠CD34 单克隆抗体），过夜孵育，加入二抗孵育30 min，DAB 染色，自来水冲洗，苏木精复染，经干燥、封片、拍照观察。采用Image-ProPlus 测定各组视网膜组织中VEGF、CD34 的累积光密度值和平均光密度值。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组乳鼠体重变化

3 组乳鼠出生后12 d、13 d、14 d、15 d 和16 d的体重比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的乳鼠体重有差别（F=19.055，P=0.000）；②3组乳鼠体重有差别（F=31.229，P=0.000）；③各组乳鼠体重变化趋势有差别（F=3.688，P=0.000）。见表1。

表1 各组乳鼠不同时间点的体重比较 （n =20，g，±s）

表1 各组乳鼠不同时间点的体重比较 （n =20，g，±s）

组别 12 d 13 d 14 d 15 d 16 d正常对照组 5.08±1.19 5.42±1.29 5.70±1.30 5.82±1.43 5.79±1.42高氧诱导组 4.39±0.37 4.50±0.38 4.53±0.39 4.52±0.41 4.63±0.38药物治疗组 4.26±0.48 4.64±0.53 4.85±0.52 5.19±0.57 5.44±0.59

2.2 各组乳鼠视网膜SOD 活力和MDA 含量比较

各组乳鼠视网膜SOD 活力和MDA 含量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常对照组比较，高氧诱导组SOD 活力降低（P＜0.05），MDA 含量升高（P＜0.05）；与高氧诱导组比较，药物治疗组SOD活力升高（P＜0.05），MDA 含量降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组乳鼠视网膜SOD 活力和MDA 含量比较（n =10，±s）

表2 各组乳鼠视网膜SOD 活力和MDA 含量比较（n =10，±s）

注：①与正常对照组比较，P ＜0.05；②与高氧诱导组比较，P ＜0.05

组别 SOD/（u/mg） MDA/（nmol/mg）正常对照组 22.564±3.323 9.882±1.361高氧诱导组 18.358±1.367① 15.507±1.785①药物治疗组 21.280±2.120② 10.383±1.086②F 值 8.005 46.761 P 值 0.002 0.000

2.3 各组乳鼠视网膜HE 染色结果

正常对照组乳鼠视网膜结构清晰、层次分明，未见病变；高氧诱导组乳鼠视网膜节细胞层疏松水肿，节细胞层和内网层内及内界膜外层见大量血管增生并伴管腔扩张，节细胞层和内网层见出血；药物治疗组节细胞层和内网层未见出血，余病变同高氧诱导组。见图1。

2.4 各组乳鼠视网膜ADP 染色结果

正常对照组乳鼠视网膜无明显深棕色沉淀，高氧诱导组乳鼠视网膜深棕色沉淀明显，药物治疗组视网膜深棕色沉淀较高氧诱导组减轻（见图2）。药物治疗组、高氧诱导组视网膜ADP 染色无灌注区面积分别为（2.62±0.55）×106μm2和（3.94±1.11）×106μm2，经t检验，差异有统计学意义（t=2.377，P=0.045），药物治疗组小于高氧诱导组。

图1 各组乳鼠视网膜 （HE 染色×400）

图2 各组乳鼠视网膜 （ADP 染色）

2.5 各组乳鼠视网膜VEGF 的表达

各组乳鼠视网膜VEGF 累积光密度值和平均光密度值比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常对照组比较，高氧诱导组视网膜VEGF 累积光密度值和平均光密度值升高（P＜0.05）；与高氧诱导组比较，药物治疗组视网膜VEGF 累积光密度值和平均光密度值降低（P＜0.05）。见表3 和图3。

表3 各组乳鼠视网膜VEGF 光密度值比较 （n =5，±s）

表3 各组乳鼠视网膜VEGF 光密度值比较 （n =5，±s）

注：①与正常对照组比较，P ＜0.05；②与高氧诱导组比较，P ＜0.05。

组别 累积光密度值 平均光密度值正常对照组 11 566.4±3 609.0 0.17535±0.02903高氧诱导组 20 652.8±4 086.5① 0.24536±0.03000①药物治疗组 14 233.2±1 557.4② 0.18555±0.02402②F 值 10.178 9.249 P 值 0.003 0.004

图3 各组乳鼠视网膜VEGF 的表达 （免疫组织化学染色×200）

2.6 各组乳鼠视网膜CD34 的表达

各组乳鼠视网膜CD34 累积光密度值和平均光密度值比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常对照组比较，高氧诱导组视网膜CD34 累积光密度值和平均光密度值升高（P＜0.05）；与高氧诱导组比较，药物治疗组视网膜CD34 累积光密度值和平均光密度值降低（P＜0.05）。见表4和图4。

表4 各组乳鼠视网膜CD34 光密度值比较 （n =5，±s）

表4 各组乳鼠视网膜CD34 光密度值比较 （n =5，±s）

注：①与正常对照组比较，P ＜0.05；②与高氧诱导组比较，P ＜0.05。

组别 累积光密度值 平均光密度值正常对照组 175 745±63 992 0.6501±0.03623高氧诱导组 319 119±105 148① 0.6999±0.01349①药物治疗组 80 470±69 778② 0.6024±0.05599②F 值 9.582 7.711 P 值 0.004 0.007

图4 各组乳鼠视网膜CD34 的表达 （免疫组织化学染色×400）

3 讨论

早产儿视网膜病变是低出生体重儿和早产儿视网膜毛细血管发育异常导致的一种视网膜病变，严重者可致盲。早产儿视网膜病变主要表现为视网膜新生血管增生、神经细胞发生凋亡，导致视网膜及视功能损害。新生血管形成涉及多种细胞因子，包括促血管生成因子和抑制血管生成因子，其中VEGF 在正常视网膜血管生成和早产儿视网膜病变发病中发挥重要作用[9]。

给氧是发生早产儿视网膜病变的主要因素，给氧可导致氧自由基增多，过多的氧自由基可引起视网膜损伤[10]。SOD 在生物体各种组织中广泛存在，为氧自由基清除剂，是重要的抗氧化酶[11]。MDA 为自由基作用于脂质、发生过氧化反应的中间产物，可引起蛋白质、核酸等生物大分子发生聚合，具有细胞毒性[12]。SOD 活力降低、MDA 含量升高表明氧化应激程度增加。VEGF 为主要促血管形成因子，在新生血管形成中发挥促进作用，其水平升高可反映新生血管形成增加[13-14]。ADP 染色深棕色沉淀增加也反映新生血管形成增加[15]。CD34 抗原主要在造血干细胞和血管内皮细胞中表达，是一种跨膜细胞糖蛋白，可用于标记新生血管。在视网膜新生血管中，CD34 阳性表达。视网膜中CD34 阳性表达增加，表明血管新生增加[16]。结合本研究结果分析高氧可诱导乳鼠视网膜病变，高氧可导致视网膜氧自由基增加，过多的氧自由基引起视网膜VEGF 和CD34 表达水平升高，VEGF 和CD34的高表达表明高氧诱导可促进新生血管形成，从而诱发早产儿视网膜病变。

目前早产儿视网膜病变的主要治疗手段包括冷凝、激光光凝、抗VEGF 等，冷凝和激光治疗虽然有一定疗效，但是对视网膜的破坏程度较大，部分患者仍有遗留视觉功能障碍和最终失明的风险[17]。抗VEGF 通过抑制异常新生血管增生治疗早产儿视网膜病变，但可带来眼内外不良反应。目前早产儿视网膜病变的治疗手段主要针对血管增殖期，通过抑制或破坏新生血管达到治疗目的[18]，但这一时期视网膜损伤已形成，故疗效不理想。

本文对氧诱导视网膜病变乳鼠模型使用依达拉奉治疗，发现与高氧诱导组比较，药物治疗组体重升高，视网膜SOD 活力升高，MDA 含量降低，视网膜VEGF、CD34 累积光密度值和平均光密度值降低；HE 染色显示视网膜病变减轻；视网膜ADP 染色无灌注区面积减小。依达拉奉为神经保护药物，对视网膜组织神经细胞具有保护作用[19-20]。依达拉奉也是一种强效抗氧化剂，清除自由基的能力很强，可通过清除氧自由基保护组织免受氧化应激损伤[21-22]。依达拉奉对视网膜病变也有保护作用，如AKIYAMA 等[23]发现依达拉奉可预防视神经损伤后小鼠视网膜变性；XU等[24]发现依达拉奉可通过PI3K/Akt/Nrf2 途径保护视网膜免受缺血再灌注引起的氧化损伤；HIRONAKA等[25]发现载有依达拉奉的脂质体可保护视网膜免受氧化应激诱导的视网膜损伤。由此可见，依达拉奉具有抑制氧化损伤保护视网膜的作用。本研究结果表明，依达拉奉可减轻氧自由基对视网膜的损伤，抑制VEGF、CD34 的表达，从而抑制氧诱导视网膜病变乳鼠视网膜新生血管形成。初步分析依达拉奉可能通过抗氧化作用减轻氧诱导视网膜病变乳鼠氧自由基损伤，降低因氧自由基损伤导致的VEGF 表达水平升高，从而抑制视网膜新生血管形成，发挥对视网膜的保护作用。

综上所述，依达拉奉对氧诱导视网膜病变具有保护作用，其机制可能与抑制视网膜氧化应激反应，从而抑制视网膜新生血管形成有关。