维甲酸对高氧环境下原代培养肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的保护机制

潘琦琦 马金帅 刘秀香 吕朦

[摘要] 目的 探討维甲酸（RA）对高氧环境下原代培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）损伤的保护机制。 方法 分离、纯化孕19 d的胎鼠肺组织，得到肺泡Ⅱ型上皮细胞进行细胞培养，待细胞生长至亚汇合（约占瓶底80%以上时）将细胞分为空气组、高氧组、高氧+RA组，其中高氧+RA组加入含有10-6 mol/L的RA。空气组置于空气中培养;高氧组与高氧+RA组置于37℃、95% O2 - 5%CO2条件下培养24 h，用测氧仪检测培养皿中的氧浓度。采用流式细胞术（AnnexinV-PI双标记）检测AECⅡ凋亡，Western blot检测Wnt通路中β-catenin蛋白质的表达，PCR检测β-catenin基因的表达。 结果 高氧组暴露24 h，AnnexinV （+）PI（-）和AnnexinV（+）PI（+）标记的AECⅡ数较空气组及高氧+RA组均显著升高（P < 0.01）;与空气组比较，高氧组β-catenin蛋白质的表达显著降低，差异有统计学意义（P < 0.01），与高氧组比较，高氧+RA组则上调高氧暴露β-catenin蛋白的表达（P < 0.01）。 结论 高氧环境下可导致AECⅡ大量凋亡、坏死;RA通过上调β-catenin蛋白的表达，降低AECⅡ坏死、凋亡，从而对高氧肺损伤起到保护作用。

[关键词] 维甲酸;高氧;肺泡Ⅱ型上皮细胞;β-catenin蛋白

[中图分类号] R563          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2018）12（c）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate protective mechanism of retinoic acid on primary cultured alveolar type Ⅱ epithelial cells under hyperoxia. Methods Alveolar type Ⅱ epithelial cells were isolated and purified from fetal rat lung tissue at 19 days of gestation. When the cells grew to the fused state （80% bottle bottom）， the cells were divided into air group， hyperoxia group and hyperoxygenation + RA group. The apoptosis of AECⅡ was detected by flow cytometry， the β-catenin protein expression of Wnt signal pathway was detected by Western blot， and the β-catenin gene expression was detected by PCR. Results Compared with the air group and the hyperoxygenation + RA group， the AECⅡ number of AnnexinV （+） PI （-） and AnnexinV （+） PI （+） markers in the hyperoxia group was significantly higher at 24 h of exposure （P < 0.01）， and the cell number was significantly reduced after RA addition. Compared with the air group， the expression of β-catenin protein of the hyperoxia group was significantly decreased， the difference was statistically significant （P < 0.01）， while compared with the high oxygen group， the expression of β-catenin protein of the hyperoxygenation + RA group was upregulated significantly （P < 0.01）. Conclusion Hyperaerobic environment can lead to massive apoptosis and necrosis of AECⅡ， and RA can reduce apoptosis of this cell by up-regulating the expression of β-catenin protein， thus playing a protective role in hyperoxic lung injury.

[Key words] Retinoic Acid; High oxygen; Type Ⅱ alveolar epithelial cell; β-catenin protein

肺泡上皮细胞包括Ⅰ型上皮细胞（alveolar epithelial type Ⅰ cells，AECⅠ）及Ⅱ型上皮细胞（alveolar epithelial type Ⅱ cells，AECⅡ）。AECⅠ主要进行气体交换，AECⅡ主要分泌肺表面活性物质，且在高氧环境下AECⅡ具有分裂、增殖并分化为AECⅠ的潜能，故具有修复受损伤上皮的作用[1-3]。新生儿呼吸窘迫综合征，又称新生儿肺透明膜病，主要是由于缺乏肺泡表面活性物质所引起的呼吸困难。氧疗是目前治疗新生儿呼吸窘迫综合征的主要措施[4]。但长期的氧疗，特别是高氧环境下会影响水通道蛋白[5-6]及视网膜受体表达[7]，从而引起肺水肿及视力障碍等。如果我们在氧疗中加入某种药物减轻高氧导致的损伤，将能有效地提高一些新生儿、早产儿的生存率。95%高浓度氧是研究高氧肺损伤中常用的浓度[8]。

Wnt经典信号通路包括 Wnt 配体蛋白、细胞膜上的受体、细胞核内调控因子、细胞浆内的信号转导部分等[9]。大量研究结果表明，此通路活化的关键是胞浆中是否存在稳定的β-catenin[10]。早期的研究证实，β-catenin可以表达于支气管上皮细胞[11]，敲出β-catenin可导致小鼠胚胎发育停滞[12]，说明Wnt/β-catenin通路参与了胚胎发育及肺泡的形成。其中Wnt7b信号分子广泛分布于AECⅡ表面，可与受体结合，抑制胞核内“破坏复合体”的解体，使得β-catenin 在胞内聚集引起下游靶基因的转录，调控组织的稳定、细胞分化、能量代谢、干细胞维持以及损伤修复等生物学效应[13-14]。维甲酸是维生素A在生物体内的重要活性形式，是调节细胞增殖及凋亡，是肺发育、修复的重要物质，可以预防早产儿的各种并发症[15]。胎儿时期，气管-支气管细胞中的维生素A酶可以促进维生素A转化成维甲酸（RA），存储于ACEⅠ及AECⅡ中，调节细胞的生长、发育、转化、凋亡[16]。可调控IGF受体的表达，进而修复损伤的肺组织。然而，RA是否能对高氧引起的肺损伤起保护作用及是否与Wnt信号通路相关尚不清楚，本研究以孕19 d的胎鼠为研究对象，探讨了Wnt通路中的关键因子β-catenin的表达情况，并为临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级成熟健康SD大鼠[山东鲁抗医药股份有限公司，动物合格证号：SCXK（鲁）2013-0019]，雌鼠（230～260 g）12只，雄鼠（280～330 g）6只。于晚上19：00～20：00，以雌雄比例1∶1合笼，次日7：30～8：00查見阴栓或者行阴道涂片检查，若在显微镜下看到精子，记为孕0 d，饲养至孕19 d进行AECⅡ的提取。DMEM培养基、胎牛血清（FBS）（美国Hyclone公司，生产批号：AD16191267）;Ⅳ型胶原酶（美国Sigma公司）、胰蛋白酶（美国Hyclone公司）、Hank′s平衡盐溶液（上海碧云天生物技术有限公司，生产批号：20170107）、Ig G包被干粉（Sigma公司）;RNA提取、反转定量试剂盒（TaKaRa公司，生产批号：20180112）;兔抗大鼠β-actin抗体（北京博奥森生物技术有限公司）;辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔（北京中杉金桥技术有限公司）;细胞凋亡检测试剂盒（凯基生物;生产批号：20170410）。

1.2 方法

1.2.1 AECⅡ原代培养  用4%水合氯醛腹腔内麻醉孕19 d的SD孕鼠。将孕鼠置于鼠台，75%酒精消毒，剖开腹腔，取出含有孕鼠的子宫，尽量去除肺组织的气管、支气管及血管，剪碎肺组织至1 mm3，于预冷的Hank′s平衡盐溶液中反复清洗，至液体清亮。用0.1%胰酶、0.1% Ⅳ型胶原酶消化肺组织至胶冻状，FBS终止消化后，100目筛网过滤，经差速离心、差速贴壁和免疫黏附纯化方法获得AECⅡ。将提取的细胞置于37℃ 5% CO2-95% O2培养中培养。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖能力  将细胞接种在96孔板上，24 h待细胞生长至80%亚融合状态时，将细胞分成对照组和不同浓度RA组（10-5、10-6、10-7、10-8 mol/L），每组设4个复孔，培养12、24、48 h后，加入含0.5/L MTT的培养基，每孔于酶标仪570 m波长处检测每孔吸光度。分别计算出不同浓度RA作用下细胞的增值及活力情况。

1.2.3 实验分组  原代AECⅡ生长至80%融合状态时，进行细胞换液，并分为三组：空气组、高氧组、高氧+RA组。其中高氧+RA组加入有终浓度为10- 6 mol/L的RA，余两组不予特殊处理。高氧组与高氧+RA组置于37℃ 95%O2-5%CO2条件下培养24 h。其中高氧组在培养结束时均用CYS-1数字式测氧仪检测培养皿中的氧浓度，氧浓度低于90%的样品弃去。

1.2.4 流式细胞仪检测AECⅡ细胞凋亡  培养细胞至24 h后分别取空气组、高氧组、高氧+RA组各1瓶，用配制的0.1%的胰酶消化细胞，经离心、PBS洗细胞、AnnexinV-PI双染色后进行进行流式细胞仪检测。实验重复3次。结果分析：左下象限代表正常细胞[AnnexinV（-）PI（-）]，左上象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞[（AnnexinV（-）PI（+）]，右下象限代表早期凋亡细胞[（AnnexinV（+）PI（-）]，右上象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞[（AnnexinV（+）PI（+）]。

1.2.5 Western blot检测AECⅡ中β-catenin蛋白质的表达  首先按照蛋白提取试剂盒说明书提取细胞蛋白;其次测定蛋白浓度，根据所测定的蛋白浓度，取各组变性后的蛋白 60 μg上样，经过跑胶、转膜、封闭后，加入兔抗鼠β-catenin多克隆抗体，4℃孵育过夜。37℃复温30 min、TBST洗膜3次后，加入二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，最后发光底液曝光。用Image J软件分析，计算β-catenin/β-actin比值，以分析蛋白表达情况。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测AECⅡ中β-catenin的mRNA含量  提取RNA，用酶标仪用酶标仪检测波长为280 nm处和260 nm处的吸光值。OD260值为RNA浓度，OD260/OD280值为RNA的纯度。引物的设计合成由生物工程（上海）股份有限公司提供，见表1。经提取RNA→溶解RNA→纯度分析→反转为cDNA→反转录→PCR反应：95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循环35次。以β-actin为内参基因，比较Ct法检测各样本的mRNA 表达情况，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt =ΔCt实验组-ΔCt对照组采用2-ΔΔCt法进行分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 倒置显微镜观察AECⅡ形态变化

AECⅡ培养24 h，贴壁良好，细胞团呈岛状分布，可见明显细胞核及核仁，折光性好。高氧组及高氧+RA组出现贴壁不牢，悬浮细胞增多，折光性下降，胞内可见明显空泡。尤以高氧组明显。见图1

2.2 不同浓度RA对原代AECⅡ细胞的作用

MTT法确定RA浓度。经单因素方差分析示10-5～10-8 mol/LRA对细胞各点无明显的抑制作用，在48 h，RA对细胞的增值作用显著（P < 0.01）。其中，在24 h时，10-6 mol/L RA具有明显的促增值作用;在48 h，促增值作用最大在10-7 mol/L。因此选择10-6 mmol/L作为干预条件。见图2。

2.3 流式细胞术检测AECⅡ的凋亡

采用AnnexinV-PI双染进行流式结果分析表明，高氧组暴露24 h，AnnexinV（+）PI（-）和AnnexinV（+）PI（+）标记的AECⅡ数高于空气组及高氧+RA组（P < 0.05）。表明RA可明显抑制高氧环境下AECⅡ凋亡。见图3。

2.4 Western blot检测各组AECⅡ中β-catenin蛋白的表达

结果显示空气组细胞内可检测到β-catenin蛋白表达，三组AECⅡ中β-catenin蛋白的表达水平比较，差异有统计学意义（F = 115.44，P < 0.01），且與空气组比较，高氧暴露组β-catenin蛋白表达水平明显降低（P < 0.01），高氧+RA组与高氧组比较，β-catenin蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义（P < 0.01）。证明RA可促进高氧组ACEⅡ中β-catenin蛋白的表达。见图4

2.5 PCR检测AECⅡ中β-catenin mRNA的含量

结果显示空气组细胞内可检测到β-catenin的mRNA表达，三组AECⅡ中β-catenin mRNA的含量比较，差异有统计学意义（F = 325，P < 0.01）;与空气组比较，高氧组β-catenin mRNA水平明显降低（P < 0.01），高氧+RA组与高氧组比较，β-catenin mRNA水平较高氧组有所升高（P < 0.05）。证明RA可促进高氧组 ACEⅡ中β-catenin mRNA的表达。见图5。

与空气组比较，*P < 0.01;与高氧组比较，#P < 0.05

3 讨论

经典Wnt信号通路与肺发育关系最为密切，其对β-catenin浓度的调控处于中心位置[10]。而β-catenin的浓度受Axin/GSK-3/APC复合体的调控，当无Wnt配体存在时，胞质中的Axin复合体处于稳定状态，复合体泛素化后被蛋白酶体降解，导致胞质中的β-catenin维持在较低浓度。相反，当Wnt配体激活后，Axin复合体解聚，胞浆内β-catenin不断积累从而处于高浓度[17]。Wnt信号通路的激活在调控肺损伤修复中起关键性的作用[11-12]。

高氧可产生较多氧自由基，产生肺部炎症，从而造成细胞凋亡。本实验结果表明，与空气组比较，高氧暴露下AnnexinV（+）PI（-）和AnnexinV（+）PI（+）标记的AECⅡ数明显升高，而加入合适浓度的RA组，细胞凋亡数量少于高氧组，说明高氧可加快细胞凋亡，RA可对AECⅡ可起到保护作用。而RA对细胞起保护作用的机制尚不明确，本研究对细胞中的β-catenin的蛋白表达水平进行检测，发现该蛋白可以在正常组表达，其适当的表达会促进肺细胞发育[18-20];在高氧组中蛋白表达明显降低，而RA+高氧组的蛋白表达量介于其余两组之间，表明RA可以通过调控该蛋白对高氧环境下AECⅡ起到抗氧化作用，而β-catenin信号分子是Wnt通路中的核心因子[10]，表明RA可能通过激活Wnt通路，引起β-catenin在细胞中积累升高，从而减少肺组织的损伤。同样条件下，采用PCR技术检测β-catenin的基因水平，高氧组β-catenin mRNA水平明显降低，而RA+高氧组的基因表达高于高氧之间，进一步表明了RA可能通过Wnt通路拮抗高氧所致的肺损伤。

综上所述，RA可对高氧引起的肺损伤起到保护作用，其机制可能与激活Wnt配体，上调β-catenin浓度相关。本实验初步证实了RA的保护作用，为临床应用RA预防高氧肺损伤奠定了一定的实验基础。

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（收稿日期：2018-07-16  本文编辑：任   念）