微小RNA-204-3p通过靶向调控Krüppel样因子6对高糖诱导小鼠足细胞损伤的保护作用

常杰

作者单位：河南大学第一附属医院全科医学科，河南 开封475000

糖尿病肾病是一种进行性肾病，由糖尿病微血管并发症引发，常常导致终末期肾病［1］，严重影响病人的生活质量。足细胞是一种终末分化细胞，附在肾小球基底膜外表面，维持肾小球基底膜完整性［2］。资料显示，足细胞是糖尿病肾病重要的早期靶细胞［3］，在糖尿病肾病进展中起着关键作用［4］，因此，研究足细胞凋亡可能为糖尿病肾病提供一种新的治疗策略。微小 RNAs（MicroRNAs，miRNAs/miR）是一类内源性非编码小RNA，参与细胞增殖、凋亡、周期、分化等多种生物学过程。越来越多的证据表明，miRNAs与糖尿病肾病发病机制有关，可作为诊断、预后及治疗的生物标志物［5-7］。微小RNA-204-3p（MicroRNA-204-3p，miR-204-3p）在高糖诱导的足细胞中表达下调，可以抑制高糖导致的足细胞凋亡［8］，但miR-204-3p是否通过靶向调控锌指蛋白Krüppel样因子 6（Krüppel-like factor 6，KLF6）表达来影响高糖诱导的小鼠足细胞损伤，这方面的研究尚未见诸报道。因此，本研究通过体外细胞实验，探讨miR-204-3p是否通过靶向调控KLF6从而影响高糖刺激的小鼠足细胞损伤，旨在阐明其作用机理。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器小鼠肾脏足细胞系MPC5购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，RPMI-1640培养基购于美国Gibco公司，胎牛血清、胰酶、D-葡萄糖、γ干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）购于Sigma公司，Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司，miR-204-3p、si-KLF6、荧光素酶报告载体购于上海吉玛生物有限公司，逆转录试剂盒、实时定量PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）试剂盒购于美国应用生物系统公司，肌动蛋白微丝偶联蛋白（synaptopodin）抗体、结蛋白（desmin）抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、KLF6抗体、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved-caspase-3）抗体、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体购于美国Cellular Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记二抗、凋亡试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所，ELC化学发光试剂盒购于美国Thermo公司。细胞培养箱购于美国Thermo公司，7500实时定量PCR仪购于美国ABI公司，倒置显微镜购于日本Olympus公司，酶标仪购于德国Eppendorf公司，BD FACSCalibur流式细胞仪购于美国BD公司。

1.2细胞培养MPC5细胞培养依据Li等［9］的方法，细胞中加入含10%胎牛血清、10 U/mL IFN-γ、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养液，在33℃、5%二氧化碳培养箱中培养。待MPC5细胞融合至80%，按1∶2～1∶3的比例接种传代。诱导足细胞分化时，将MPC5细胞转入不含IFN-γ的培养液，置37℃孵育2周。实验前，血清饥饿24 h以同步化细胞。

1.3细胞分组与转染收集MPC5细胞，加入D-葡萄糖进行干预，将细胞按随机数字表法分为正常对照组（NG组，D-葡萄糖5 mmol/L），高糖刺激组（HG组，D-葡萄糖30 mmol/L），miR-204-3p过表达组（HG+miR-204-3p组和HG+miR-NC组，miR-204-3p或miR-NC转染高糖刺激组细胞），抑制KLF6表达组（HG+si-KLF6组和HG+si-NC组，si-KLF6或si-NC转染高糖刺激组细胞），KLF6过表达组（HG+miR-204-3p+pcDNA-KLF6组和HG+miR-204-3p+pcDNA组，miR-204-3p和pcDNA-KLF6或miR-204-3p+pcDNA共转染高糖刺激组细胞），培养48 h。细胞转染时，按照Lipofectamine 2000试剂说明书步骤，将miR-204-3p、si-KLF6、pcDNA-KLF6及各自对照转染入MPC5细胞，并培养48 h备用。

1.4 qPCR检测目的基因表达提取MPC5细胞总RNA，合成互补DNA（cDNA），以制成的cDNA为模板，检测各组细胞中miR-204-3p与KLF6 mRNA水平。在实时定量PCR仪中进行反应，条件设置为95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，40个循环后检测扩增曲线和熔解曲线，收集Ct值，以2-ΔΔCt法进行分析，计算miR-204-3p与KLF6 mRNA相对表达量。

1.5蛋白质印迹法（Western Blot）检测目的蛋白表达为检测目的蛋白表达，在细胞中加入RIPA裂解液充分提取总蛋白，蛋白与上样缓冲液混匀，沸水变性10 min，后经10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分离后转移到聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h，以一抗（1∶1 000）4℃孵育过夜，用Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）充分洗膜，室温下用辣根过氧化物酶标记二抗（1∶2 000）孵育1 h，TBST充分洗膜，ECL进行显色、显影，拍照，以GAPDH作为内参蛋白，计算蛋白相对表达量。

1.6流式细胞仪检测细胞凋亡收集MPC5细胞，加入胰酶消化，将细胞密度调整为1×105/mL，加入500µL膜联蛋白V（Annexin V）缓冲液重悬细胞，加入5µL Annexin V-异硫氰酸荧光素（FITC）和5µL碘化丙啶（PI），于室温黑暗条件孵育30 min，上流式细胞仪评估细胞凋亡率。

1.7靶基因预测及双荧光素酶报告基因利用生物 信 息 学 软 件 TargetScan（http：//www.targetscan.org/）预测 KLF6的 3’非翻译区（3’untranslated region，3’UTR）中含有与miR-204-3p互补的核苷酸序列，构建野生型（WT-KLF6）和突变型（MUT-KLF6）KLF6的3’UTR荧光素酶报告基因载体，并分别共转染miR-204-3p或anti-miR-204-3p，培养48 h后，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒步骤测定双荧光素酶活性。

1.8统计学方法每个独立实验均重复3次，结果以表示，采用SPSS 22.0软件对实验数据进行整理分析，采用两独立样本t检验比较两组间数据差异，采用单因素方差分析比较多组数据间差异，采用SNK-q检验比较组间多重差异，P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-204-3p和KLF6在高糖诱导的小鼠足细胞中的表达HG组高糖诱导的小鼠足细胞MPC5中miR-204-3p表达量较NG组显著降低（P＜0.05），KLF6 mRNA和蛋白表达量明显提高（P＜0.05），见图1、表1。

图1 蛋白质印迹法检测KLF6在高糖诱导小鼠肾脏足细胞中的表达

表1 miR-204-3p和KLF6在高糖诱导小鼠肾脏足细胞中的表达/

表1 miR-204-3p和KLF6在高糖诱导小鼠肾脏足细胞中的表达/

注：miR-204-3p为微小RNA-204-3p，KLF6为锌指蛋白Krüppel样因子6，NG组为正常对照组，HG组为高糖刺激组

KLF6蛋白0.46±0.04 0.89±0.08 14.423＜0.001组别NG HG t值P值重复次数3 3 miR-204-3p 1.02±0.08 0.41±0.04 20.460＜0.001 KLF6 mRNA 1.03±0.08 2.86±0.27 19.496＜0.001

2.2 miR-204-3p过表达对高糖刺激小鼠肾脏足细胞中synaptopodin和desmin表达的影响蛋白质印迹法检测结果显示，相比于NG组，HG组小鼠肾脏足细胞MPC5中miR-204-3p和synaptopodin蛋白表达量显著降低，desmin表达量明显升高（P＜0.05）。相比于HG+miR-NC组，miR-204-3p过表达大幅增加高糖刺激的小鼠肾脏足细胞MPC5中miR-204-3p表达量（P＜0.05），表明转染成功。miR-204-3p过表达明显提高高糖刺激的小鼠肾脏足细胞MPC5中synaptopodin蛋白水平，降低desmin蛋白水平（P＜0.05）。见图2、表2。

图2 蛋白质印迹法检测miR-204-3p过表达对高糖刺激小鼠肾脏足细胞中synaptopodin和desmin表达的影响

2.3 miR-204-3p过表达对高糖刺激小鼠肾脏足细胞凋亡的影响与NG组比较，HG组小鼠肾脏足MPC5细胞凋亡率明显升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表达量明显降低，Bax蛋白与cleaved-caspase-3蛋白表达量显著升高（P＜0.05）。与HG+miR-NC组比较，miR-204-3p过表达小鼠肾脏足MPC5细胞凋亡率显著减少（P＜0.05），明显提高Bcl-2蛋白水平而降低Bax蛋白与cleaved-caspase-3蛋白水平（P＜0.05）。见图3、表3。

表2 miR-204-3p过表达对高糖刺激小鼠肾脏足细胞中synaptopodin和desmin表达的影响/

表2 miR-204-3p过表达对高糖刺激小鼠肾脏足细胞中synaptopodin和desmin表达的影响/

注：miR-204-3p为微小RNA-204-3p，synaptopodin为肌动蛋白微丝偶联蛋白，desmin为结蛋白，NG为正常对照组，HG为高糖刺激组，HG+miR-NC为高糖刺激后给予miR-204-3p阴性对照（miR-NC）干预组，HG+miR-204-3p为高糖刺激后给予miR-NC干预组miR-204-3p干预。与NG组比较，aP＜0.05；与HG+miR-NC组比较，bP＜0.05

desmin蛋白0.34±0.03 0.81±0.07a 0.83±0.08 0.41±0.04b 174.500＜0.001组别NG HG HG+miR-NC HG+miR-204-3p F值P值重复次数3 3 3 3 miR-204-3p 1.00±0.09 0.32±0.03a 0.34±0.04 0.86±0.08b 261.176＜0.001 synaptopodin蛋白0.76±0.07 0.34±0.03a 0.32±0.03 0.67±0.06b 177.641＜0.001

表3 miR-204-3p过表达对高糖刺激小鼠肾脏足细胞凋亡及其相关蛋白表达的影响/

表3 miR-204-3p过表达对高糖刺激小鼠肾脏足细胞凋亡及其相关蛋白表达的影响/

注：miR-204-3p为微小RNA-204-3p，NG为正常对照组，HG为高糖刺激组，HG+miR-NC为高糖刺激后给予miR-204-3p阴性对照（miR-NC）干预组，HG+miR-204-3p为高糖刺激后给予miR-NC干预组miR-204-3p干预，Bcl-2为B细胞淋巴瘤/白血病-2，Bax为Bcl-2相关X蛋白，cleaved-caspase-3为活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3。与NG组比较，aP＜0.05；与HG+miR-NC组比较，bP＜0.05

cleavedcaspase-3蛋白0.24±0.03 0.59±0.05a 0.61±0.06 0.35±0.03b 150.797＜0.001组别NG HG HG+miR-NC HG+miR-204-3p t值P值重复次数3 3 3 3细胞凋亡率/%5.26±0.64 22.46±2.08a 24.58±2.47 11.25±1.65b 224.087＜0.001 Bcl-2蛋白0.68±0.06 0.28±0.03a 0.26±0.03 0.59±0.05b 208.823＜0.001 Bax蛋白0.31±0.03 0.73±0.07a 0.76±0.07 0.42±0.04b 147.220＜0.001

2.4抑制KLF6表达对高糖刺激小鼠肾脏足细胞损伤的影响相较于NG组，HG组小鼠肾脏足细胞MPC5中KLF6蛋白、desmin蛋白、Bax蛋白表达量及细胞凋亡率显著增加（P＜0.05），synaptopodin蛋白及Bcl-2蛋白表达量显著减少（P＜0.05）。HG+si-KLF6组小鼠肾脏足细胞MPC5中KLF6蛋白水平较HG+si-NC组显著降低（P＜0.05），表明转染成功。相较于HG+si-NC组，HG+si-KLF6组抑制KLF6表达明显提升synaptopodin蛋白及Bcl-2蛋白水平（P＜0.05），而降低desmin蛋白、Bax蛋白水平及细胞凋亡率（P＜0.05）。见图4、表4。

图4 蛋白质印迹法检测抑制KLF6表达对高糖刺激小鼠肾脏足细胞损伤的影响

2.5 miR-204-3p靶向调控KLF6表达通过TargetScan网站预测miR-204-3p与KLF6的3’UTR部分碱基可形成互补配对，推测miR-204-3p对KLF6表达存在一定调控作用。双荧光素酶报告基因检测发现共转染miR-204-3p抑制WT-KLF6 3’UTR报告基因的荧光素酶相对活性（P＜0.05），对MUT-KLF6 3’UTR报告基因的荧光素酶相对活性无明显作用（P＞0.05）。蛋白质印迹法结果显示转染miR-204-3p组较miR-NC组显著抑制KLF6蛋白表达［（0.21±0.03）比（0.46±0.04），P＜0.05］，转染anti-miR-204-3p组较anti-miR-NC组明显提升KLF6蛋白水平［（0.87±0.08）比（0.43± 0.04），P＜0.05］（F＝259.743，P＜0.001）。见图5、表5。

表4 抑制KLF6表达对高糖刺激小鼠肾脏足细胞损伤的影响/

表4 抑制KLF6表达对高糖刺激小鼠肾脏足细胞损伤的影响/

注：KLF6为锌指蛋白Krüppel样因子6，NG为正常对照组，HG为高糖刺激组，HG+si-NC为高糖刺激后给予si-NC干预组，HG+si-KLF6为高糖刺激后给予si-KLF6干预组干预，synaptopodin为肌动蛋白微丝偶联蛋白，desmin为结蛋白，Bcl-2为B细胞淋巴瘤/白血病-2，Bax为Bcl-2相关X蛋白。与NG组比较，aP＜0.05；与HG+si-NC组比较，bP＜0.05

组别NG HG HG+si-NC HG+si-KLF6 F值P值细胞凋亡率/%7.02±0.71 23.46±2.15a 25.47±2.68 14.69±1.87b 164.495＜0.001重复次数3 3 3 3 KLF6蛋白0.43±0.04 0.86±0.08a 0.88±0.07 0.54±0.05b 120.370＜0.001 synaptopodin蛋白0.75±0.07 0.31±0.03a 0.28±0.03 0.62±0.06b 187.573＜0.001 desmin蛋白0.33±0.03 0.83±0.07a 0.86±0.08 0.49±0.05b 165.286＜0.001 Bcl-2蛋白0.69±0.06 0.29±0.03a 0.27±0.02 0.53±0.05b 197.676＜0.001 Bax蛋白0.32±0.03 0.75±0.07a 0.74±0.06 0.49±0.04b 141.927＜0.001

注：WT-KFL6为野生型KLF6，3’UTR为3’非翻译区，miR-204-3p为微小RNA-204-3p，MUT-KLF6为突变型KLF6，KLF6为锌指蛋白Krüppel样因子6，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，a为miR-204-3p阴性对照，b为miR-204-3p，c为抗miR-204-3p阴性对照，d为抗miR-204-3p

表5 双荧光素酶报告实验检测miR-204-3p靶向调控KLF6的表达/

表5 双荧光素酶报告实验检测miR-204-3p靶向调控KLF6的表达/

注：miR-204-3p为微小RNA-204-3p，KLF6为锌指蛋白Krüppel样因子6，miR-NC为miR-204-3p阴性对照，WT-KFL6为野生型KLF6，MUT-KLF6为突变型KLF6

MUT-KLF6 1.02±0.08 1.00±0.09 0.498 0.625组别miR-NC miR-204-3p t值P值重复次数3 3 WT-KFL6 1.03±0.09 0.41±0.04 18.885＜0.001

2.6 KLF6过表达逆转了miR-204-3p过表达对高糖刺激小鼠肾脏足细胞损伤的作用HG+miR-204-3p组比HG+miR-NC组显著降低MPC5细胞中KLF6蛋白水平（P＜0.05），明显影响synaptopodin蛋白、desmin蛋白、Bax蛋白、Bcl-2蛋白水平及细胞凋亡率（P＜0.05），结果同“2.2”和“2.3”。与HG+miR-204-3p+pcDNA组比较，HG+miR-204-3p+pcDNA-KLF6组显著增加高糖刺激小鼠肾脏足MPC5细胞中KLF6蛋白表达量（P＜0.05），显著减少synaptopodin蛋白和Bcl-2蛋白表达量（P＜0.05），升高desmin蛋白、Bax蛋白表达量和细胞凋亡率（P＜0.05）。见图6、表6。

图6 蛋白质印迹法检测KLF6过表达逆转了miR-204-3p过表达对高糖刺激小鼠肾脏足细胞损伤的作用

3 讨论

miRNAs长度约为22个核苷酸，通过与下游靶mRNA的3’UTR发生特异性结合，调控基因表达，导致mRNA翻译受到抑制或直接降解miRNA［10］。miRNAs异常表达与许多疾病的发生发展有关，包括糖尿病肾病［11-13］，如miR-770-5p通过靶向TP53调控足细胞增殖与凋亡，参与糖尿病肾病的发生发展［14］。Jo等［15］研究发现，miR-204直接靶向胰高血糖素样肽1受体（GLP1R）3’UTR，miR-204的缺失促进胰岛GLP1R表达，增强其对GLP1R激动剂的反应，从而改善葡萄糖耐受性，cAMP产生和胰岛素分泌，以及对糖尿病的预防作用。synaptopodin是一种与肌动蛋白微丝偶联的蛋白，可作为足细胞分化成熟的标志性分子，desmin是足细胞骨架中间丝蛋白，也是足细胞损伤的标志之一。在高糖刺激条件下，足细胞中synaptopodin蛋白水平降低，desmin水平提高，二者的异常表达与糖尿病肾病足细胞损伤密切相关［16］。本研究中，miR-204-3p在高糖刺激的MPC5细胞中显著下调（P＜0.05），miR-204-3p过表达提升高糖刺激MPC5细胞中synaptopodin、Bcl-2蛋白水平，降低细胞凋亡率、desmin、Bax蛋白与cleaved-caspase-3蛋白水平。说明miR-204-3p可以保护高糖诱导小鼠足细胞损伤，并抑制细胞凋亡，与Han等［8］研究结果一致。

表6 KLF6过表达逆转了miR-204-3p过表达对高糖刺激小鼠肾脏足细胞损伤的作用/

表6 KLF6过表达逆转了miR-204-3p过表达对高糖刺激小鼠肾脏足细胞损伤的作用/

注：KLF6为锌指蛋白Krüppel样因子6，miR-204-3p为微小RNA-204-3p，HG+miR-NC为高糖刺激后给予miR-204-3p阴性对照（miR-NC）干预组，HG+miR-204-3p为高糖刺激后给予miR-204-3p干预组干预，HG+miR-204-3p+pcDNA为高糖刺激后给予miR-204-3p+pcDNA干预组，HG+miR-204-3p+pcDNA-KLF6为高糖刺激后给予miR-204-3p+pcDNA-KLF6干预组，synaptopodin为肌动蛋白微丝偶联蛋白，desmin为结蛋白，Bcl-2为B细胞淋巴瘤/白血病-2，Bax为Bcl-2相关X蛋白。与HG+miR-NC组比较，aP＜0.05；与HG+miR-204-3p+pcDNA组比较，bP＜0.05

凋亡率/%23.65±2.47 12.41±1.36a 11.05±1.02 18.41±1.67b 103.034＜0.001组别HG+miR-NC HG+miR-204-3p HG+miR-204-3p+pcDNA HG+miR-204-3p+pcDNA-KLF6 F值P值重复次数3 3 3 3 KLF6蛋白0.83±0.08 0.39±0.03a 0.37±0.04 0.71±0.07b 138.696＜0.001 synaptopodin蛋白0.29±0.03 0.68±0.06a 0.69±0.07 0.38±0.03b 147.495＜0.001 desmin蛋白0.82±0.08 0.38±0.03a 0.36±0.04 0.68±0.06b 148.224＜0.001 Bcl-2蛋白0.24±0.03 0.57±0.05a 0.58±0.06 0.35±0.03b 128.354＜0.001 Bax蛋白0.77±0.06 0.34±0.03a 0.32±0.03 0.63±0.06b 195.867＜0.001

Krüppel样因子（Krüppel-like factors，KLFs）是一种高度保守的锌指蛋白，能结合特定的DNA基序并调节多种细胞功能，如细胞增殖、凋亡、分化和代谢［17］。KLF6是KLFs家族成员之一，在前列腺癌、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、透明细胞肾细胞癌中等癌症中表达异常［18-19］，在肾脏疾病等的发生发展中发挥着重要作用［20-23］。资料显示，KLF6糖尿病大鼠模型近端肾小管上皮细胞中KLF6高表达［24］。高浓度葡萄糖可诱导人晶体上皮细胞中KLF6基因表达上调［25］。在糖尿病性肺纤维化大鼠模型中，KLF6蛋白和mRNA水平升高，高糖诱导KLF6表达量增加［26］。本实验中，高糖刺激明显促进MPC5细胞KLF6 mRNA和蛋白表达。抑制KLF6表达显著上调高糖诱导MPC5细胞synaptopodin及Bcl-2蛋白水平，降低细胞凋亡率及desmin、Bax蛋白表达。提示KLF6是高糖刺激足细胞损伤过程中关键的影响因子。

为了进一步观察miR-204-3p是否通过靶向KLF6来保护高糖诱导的小鼠足细胞损伤，采用生物学信息预测结合双荧光素酶报告基因进行分析与验证，结果证实KLF6是miR-204-3p的靶基因。上调或下调miR-204-3p表达明显调控KLF6水平，表明miR-204-3p对KLF6表达呈负调控作用。此外，KLF6过表达逆转miR-204-3p过表达对synaptopodin及Bcl-2蛋白表达的促进作用，及逆转miR-204-3p过表达对desmin、Bax蛋白表达和细胞凋亡的抑制作用。说明miR-204-3p直接靶向KLF6保护高糖刺激的小鼠足细胞损伤，并抑制细胞凋亡。

综上所述，miR-204-3p通过靶向调控KLF6，从而保护高糖诱导的小鼠足细胞损伤，并抑制细胞凋亡，为糖尿病肾病的诊治提供潜在靶点。

（本文图3见插图12-4）