一测多评法同时测定保肝丸中4个指标性成分的含量

2020-12-08任莹吕晓军李德林王虎

安徽医药 2020年12期

任莹，吕晓军，李德林，王虎

作者单位：太和县中医院制剂室，安徽阜阳236600

保肝丸是太和县中医院国家级重点科室肝病科临床应用多年的专用方，主要由党参、白芍、大黄等中药组成。保肝丸作为疗效显著且临床应用多年的医院传统中药制剂，亟须建立完善的质量控制及评价方法，为该制剂的物质基础研究和临床推广应用奠定基础。本研究于2018年6—12月以对照品便宜易得的黄芩苷为内标，建立保肝丸中主要药味的指标性成分芍药苷、五味子醇甲、大黄素含量的QAMS，以期为保肝丸的质量控制提供更全面可靠的依据，进而保证制剂质量，确保临床疗效。

1 仪器与试剂

UltiMate3000高效液相色谱仪［二极管阵列检测器（DAD），赛默飞世尔科技有限公司］；Agilent1220型高效液相色谱仪（紫外检测器，安捷伦科技有限公司）；XP205DR型十万分之一分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-500DE超声波清洗仪（昆山超声仪器有限公司），万能粉碎机（上海贺帆仪器有限公司）。

对照品黄芩苷（110715-201720），芍药苷（110736-201640），五味子醇甲（110857-201714），大黄素（110756-201512）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇，均为色谱纯，美国天地公司；磷酸，分析纯，天津北方天医化学试剂厂；哇哈哈纯净水。

保肝丸为太和县中医院中药制剂室生产，批号分别为 20170826、20171012、20171221、20180127、20180306、20180509。缺味阴性样品均由中药制剂室自制。

2 方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备分别取芍药苷、黄芩苷、五味子醇甲、大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为0.683 1、0.442 1、0.374 5、0.368 1 g/L的对照品储备液。分别精密吸取芍药苷、黄芩苷、五味子醇甲、大黄素储备液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇定容制成6个质量浓度不同的混合对照品溶液，分别编号1、2、3、4、5、6。

2.1.2 供试品溶液的制备取保肝丸适量，粉碎，过四号筛，精密称取约1 g，加甲醇25 mL，称重，超声处理30 min，放冷，称重，用甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

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2.1.3 保肝丸缺白芍溶液的制备按保肝丸的制备工艺制得缺白芍的阴性样品，按“2.1.2”项下的制备方法制备缺白芍阴性供试液。

2.1.4 保肝丸缺黄芩溶液的制备按保肝丸的制备工艺制得缺黄芩的阴性样品，按“2.1.2”项下的制备方法制备缺黄芩阴性供试液。

2.1.5 保肝丸缺五味子溶液的制备按保肝丸的制备工艺制得缺五味子的阴性样品，按“2.1.2”项下的制备方法制备缺五味子阴性供试液。

2.1.6 保肝丸缺大黄溶液的制备按保肝丸的制备工艺制得缺大黄的阴性样品，按“2.1.2”项下的制备方法制备缺大黄阴性供试液。

2.2色谱条件UltiMate3000高效液相色谱仪，依利特Hypersil ODS2色谱柱（4.6 mm×250 mm，5µm），以乙腈和0.01%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，梯度洗脱时间及比例见表1，流速1.0 mL/min，柱温30℃，分段变波长测定0～25 min，230 nm、＞25～50 min，280 nm，＞50～90 min，254 nm。

表1 UltiMate3000高效液相色谱仪梯度洗脱时间表

2.3方法学考察

2.3.1 专属性考察按“2.2”色谱条件，分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、各缺味阴性对照溶液，依次注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果显示，各阴性对照均无干扰（图1），说明该方法专属性较好。

2.3.2 线性关系考察分别精密吸取“2.1.1”项下系列混合对照品溶液各5µL，注入高效液相色谱仪。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得各成分的回归方程、相关系数，具体见表2。

表2 混合对照品溶液4种成分线性关系考察结果

2.3.3 精密度试验取保肝丸样品（批号20180127），按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，记录芍药苷、黄芩苷、五味子醇甲、大黄素的峰面积，计算各成分峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为0.34%、0.62%、0.21%、0.22%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验取保肝丸样品（批号20180127），按照“2.1.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，分别进样，记录各色谱峰的峰面积。计算结果显示芍药苷、黄芩苷、五味子醇甲、大黄素的平均含量分别为1.708、1.106、0.935、0.921 mg/g，RSD分别为1.02%、0.87%、1.16%、0.68%，表明该方法的重复性良好。

2.3.5 稳定性试验取保肝丸样品（批号20180127），按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别于样品制备后0、2、4、8、12、24 h进样，记录各色谱峰的峰面积。计算得芍药苷、黄芩苷、五味子醇甲、大黄素峰面积的RSD分别为0.65%、0.79%、1.04%、0.92%，表明供试品溶液在24 h内较为稳定。

2.3.6 加样回收率试验取保肝丸样品（批号20180127）6份，每份约0.5 g，精密称定，加入一定量对照品溶液，使样品中待测成分量与对照品加入量大致相等，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样并记录各色谱峰的峰面积。计算得芍药苷、黄芩苷、五味子醇甲、大黄素的平均加样回收率分别为98.65%、101.23%、99.32%、97.58%，RSD分别为1.26%、1.04%、1.35%、1.13%。表明该方法准确度较高。

2.4相对校正因子的确定

2.4.1 相对校正因子的测定本实验采用多点校正法［1］，取“2.1.1”项下制备的系列混合对照品溶液，按照“2.2”项下色谱条件分别进样5µL，记录各对照品色谱峰面积，按照公式fk/m＝fk/fm＝（Wk×Am）/（Wm×Ak）（式中Ak为内参物的峰面积，Wk为内参物的质量或浓度；Am为待测物的峰面积，Am为待测物的质量或浓度），以黄芩苷为内参物，分别计算芍药苷、五味子醇甲、大黄素的相对校正因子［9］，结果见表3。

表3 指标性成分的相对校正因子

2.4.2 不同仪器和色谱柱对校正因子的影响分别采用赛默飞UltiMate3000、Agilent1220型高效液相色谱仪；依次利用依利特Hypersil ODS2、Thermo Syncrois C18、Agilent ZORBAX SB C18色谱柱，取系列对照品进样检测，按照“2.4.1”项下公式，计算各成分的相对校正因子，考察不同色谱仪器和色谱柱对各待测成分的相对校正因子的影响，结果见表4，5。结果表明不同仪器和不同色谱柱对各成分的相对校正因子无明显影响。

表4 不同仪器对相对校正因子的影响

表5 不同色谱柱对相对校正因子的影响

2.5样品测定及准确性验证分别采用外标法和一测多评法（QAMS）测定6批保肝丸中4种指标性成分芍药苷、黄芩苷、五味子醇甲、大黄素的含量，并将两种方法的计算结果进行比较，结果表明外标法和本实验建立的一测多评法所得结果无明显差异，各待测成分的相对校正因子可靠，该一测多评法准确度较高。见表6。

3 讨论

中药具有多成分、多靶点的作用特点，中药的多种活性成分是其发挥疗效的物质基础，因此多成分的质控模式已成为中药质量控制的重点［10-12］。本实验测定的4种成分芍药苷、黄芩苷、五味子醇甲、大黄素是处方中主要指标性成分。研究表明黄芩苷能改善炎症及肝细胞凋亡，减轻肝细胞损伤程度，且效果与黄芩苷用量相关［13］，另有动物实验表明黄芩苷对肝纤维化的发生和发展具有抑制作用［14］；芍药苷能抑制肝损伤中炎性因子的产生，提高肝组织中胆盐输出泵（BSEP）和多药耐药蛋白（MRP2）的表达［15-16］；五味子醇甲能抗氧化、对肝损伤具有保护作用［17］；大黄素能降低肝细胞炎症反应，减少肝细胞凋亡，进而减轻肝细胞损伤程度［18］，对胆汁淤积引起的肝损伤具有保护作用［19］。

本实验测定的4种指标性成分，化学结构差异较大，为能够同时分离检测4种成分，对各实验条件及参数进行了反复摸索。首先采用单因素变量法考察了提取条件，包括提取溶剂、提取方式、提取时间，优选出25倍甲醇超声处理30 min。其次，流动相方面选择洗脱能力较强的乙腈和0.1%磷酸水溶液，各个目标峰均能达到较好的分离度且峰型较好。最后检测波长考察，根据4种成分的紫外全波长扫描结果，选择分段检测，即230 nm检测芍药苷，280 nm检测黄芩苷，254 nm检测五味子醇甲和大黄素。

该实验利用梯度洗脱的方法使4种成分均能达到较高的分离度，并通过专属性实验证明各成分的含量测定均无干扰；选择DAD检测器进行分波段检测，虽然化学结构差异较大，各成分仍能有较高的信号相应，精密度较高；同时线性关系考察结果显示在一定范围内各成分的峰面积与进样量呈良好线性关系；加样回收实验的结果显示含量测定的准确度较高。以上试验作为该方法的前期方法学考察，显示了该方法在分离检测上的准确性和可靠性，为下一步的数学模式分析奠定基础。QAMS是以一种组分为内参，通过建立其与其他待测成分的相对校正因子，实现以一种对照品同时测定多个指标成分的目的。故相对校正因子是影响QAMS的准确度的决定性因素，而实际运用中，待测组分的浓度及色谱系统因素均会对相对校正因子产生影响。实验在充分考虑浓度因素的情况下，运用多点校正法［1］计算相对校正因子；并进一步重点考察了不同色谱仪、不同色谱柱的相对校正因子，结果显示RSD均小于2%，表明该方法的系统适应性较好。最后，通过比较外标法和QAMS的测定结果，两种方法无明显差异，说明各待测成分的相对校正因子可靠，该QAMS准确度较高。