罗哌卡因对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响及作用机制

王铭，司小萌，陈欢，郭培霞，张朔，梁玉柱

作者单位：南阳市中心医院手术一部，河南 南阳473006

骨肉瘤是常见的多发生于青少年的原发性骨恶性肿瘤之一，具有较高的病死率［1］。目前，骨肉瘤的治疗以手术为主，手术期是肿瘤发展最易受影响的阶段［2］。手术期麻醉药物的使用可抑制机体的免疫功能，增加肿瘤的转移和复发［3-4］。罗哌卡因（Ropivacaine）是临床常用的局部麻醉药物之一，研究显示，其可降低乳腺癌、甲状腺癌等多种肿瘤细胞的增殖能力［5-6］。但目前，罗哌卡因对骨肉瘤的影响及作用机制还未知。miR-199b-5p是一种微小RNA（miRNA），参与多种肿瘤的发展进程。研究显示，miR-199b-5p高表达与骨肉瘤病人预后不良密切相关，抑制miR-199b-5p表达降低了骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，是骨肉瘤潜在的分子治疗靶点［7］。本研究于2018年12月至2019年6月以骨肉瘤MG63细胞为研究对象，主要探讨了罗哌卡因能否调控miR-199b-5p表达影响MG63细胞的增殖和凋亡。

1 材料与方法

1.1细胞和试剂骨肉瘤细胞系MG63，中国科学院上海细胞库；DMEM高糖培养基、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）试剂盒，北京索莱宝公司；胎牛血清，杭州四季青公司；噻唑蓝（MTT）和胰蛋白酶，美国Sigma公司；鼠抗人细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、P21、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）单克隆抗体，美国Santa Cruz公司；Trizol试剂、逆转录试剂盒和PCR试剂盒，日本TaKaRa公司；miR-199b-5p模拟物（mimics）、模拟对照序列（miR-NC）、抑制剂（antimiR-199b-5p）及阴性对照（anti-miR-NC），上海吉玛公司；引物序列由上海生工生物技术公司设计并合成；LipofectamineTM2000试剂盒，美国Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1 细胞培养和转染 从液氮罐中取出装有MG63细胞的冻存管，置于37℃水浴中使其快速溶解，转移细胞冻存液于洁净的离心管中。预冷的磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗细胞2次，加含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。将对数增殖期的MG63细胞以5.0×105个/孔接种于6孔板中，采用LipofectamineTM2000脂质体法，分别转染miR-199b-5p mimics、miR-NC、anti-miR-199b-5p及anti-miR-NC，转染时间为6 h。然后更换培养基，再培养48 h，收集细胞备用。

1.2.2 细胞分组处理 未转染的MG63细胞分为对照组（Con组）、低剂量罗哌卡因组（Ropivacaine-L组）、中剂量罗哌卡因组（Ropivacaine-M组）、高剂量罗哌卡因组（Ropivacaine-H组），其中Con组细胞用常规培养基培养，Ropivacaine-L组、Ropivacaine-M组、Ropivacaine-H组细胞分别用含20、50、100 mg/L［8］的罗哌卡因培养。转染anti-miR-199b-5p、anti-miR-NC的细胞常规培养基培养，分别记为anti-miR-199b-5p组、anti-miR-NC组。转染miR-199b-5p mimics、miRNC的细胞均用含50µg/mL罗哌卡因的培养基培养，并分别记为Ropivacaine-M+miR-199b-5p组、Ropivacaine-M+miR-NC组。

1.2.3 细胞增殖检测 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）检测Con组、Ropivacaine-L组、Ropivacaine-M组、Ropivacaine-H组、anti-miR-199b-5p组、anti-miR-NC组、Ropivacaine-M+miR-199b-5p组、Ropivacaine-M+miR-NC组细胞增殖［9］。MG63细胞以5×103个/孔接种于96孔板中，贴壁后，按“1.2.2”分组处理。分别培养24 h、48 h和72 h后，加20 µL MTT（5 g/L）。再孵育4 h，弃培养基，加150µL二甲基亚砜，振荡混匀，酶标仪490 nm处测吸光度。

1.2.4 细胞凋亡检测 流式细胞仪检测Con组、Ropivacaine-M组、anti-miR-199b-5p组、anti-miR-NC组、Ropivacaine-M+miR-199b-5p组、Ropivacaine-M+miR-NC组细胞凋亡［10］。MG63细胞以5×104个/孔接种于24孔板中，贴壁后，按“1.2.2”分组处理。培养48 h后，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，PBS清洗细胞2次。参照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书，采用流式细胞仪检测。

1.2.5 MG63细胞中miR-199b-5p表达水平检测实时荧光定量逆转录PCR（RT-qPCR）检测Con组、Ropivacaine-M组、anti-miR-199b-5p组、anti-miR-NC组、Ropivacaine-M+miR-199b-5p组、Ropivacaine-M+miR-NC组MG63细胞中miR-199b-5p表达水平［11］。MG63细胞以5×104个/孔接种于24孔板中，贴壁后，按“1.2.2”分组处理。培养48 h后，收集细胞。Trizol试剂提取细胞中总RNA，并逆转录为互补DNA（cDNA）。以cDNA为模板，行PCR扩增。引物序列：miR-199b-5p正向5’-CCCAGTGTTTAGACTACCTGTTC，反向5’-GAATCGAGCACCAGTTACGC；U6正向 5’-CCATCGGAAGCTCGTATACGA-3’，反向 5’-GGCCTCTCGAACTTGCGTGTC-3’。2-△△Ct法计算miR-199b-5p相对于内参U6的表达水平。

1.2.6 细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、P21、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）表达水平检测 蛋白质印迹法（Western Blot）检测Con组、Ropivacaine-M组、anti-miR-199b-5p组、anti-miRNC组、Ropivacaine-M+miR-199b-5p组、Ropivacaine-M+miR-NC组细胞中CyclinD1、P21、Bcl-2和Bax蛋白表达水平［12］。MG63细胞以5×104个/孔接种于24孔板中，贴壁后，按“1.2.2”分组处理。培养48 h后，收集细胞。RIPA试剂提取细胞中总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳。电泳后，转至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），并于5%脱脂奶粉溶液中封闭1 h。分别置于CyclinD1（1∶500）、P21（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）和Bax（1∶1 000）一抗孵育液中，4 ℃孵育过夜。再置于山羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育液中，37℃孵育1 h。最后加显影液避光显影，曝光拍照。

1.3统计学方法利用SPSS 22.0软件分析实验数据。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1罗哌卡因对细胞MG63增殖的影响与Con组比较，Ropivacaine-M组、Ropivacaine-H组MG63细胞在培养48、72 h后的吸光度降低（P＜0.05）。Con组、Ropivacaine-L组、Ropivacaine-M组、Ropivacaine-H组MG63细胞中Cyclin D1蛋白水平分别为（0.95±0.09）、（0.85±0.08）、（0.66±0.06）、（0.41±0.04），P21蛋白水平分别为（0.14±0.01）、（0.18±0.02）、（0.37±0.04）、（0.71±0.07）。与Con组比较，Ropivacaine-M组、Ropivacaine-H组MG63细胞中Cyclin D1和P21的蛋白水平均差异有统计学意义（P＜0.05）。由于Ropivacaine-M组MG63细胞培养48 h后抑制率约为50%，因此选用50µg/mL的罗哌卡因作用MG63细胞48 h进行后续实验。见图1、表1。

2.2罗哌卡因对细胞MG63凋亡的影响Con组MG63细胞凋亡率、Bax和Bcl-2的蛋白水平分别为（7.66±0.75）%、（0.28±0.03）、（0.76±0.07），Ropivacaine-M组MG63细胞凋亡率、Bax和Bcl-2的蛋白水平分别为（23.51±2.42）%、（0.89±0.09）、（0.20±0.02），两组MG63细胞凋亡率、Bax和Bcl-2的蛋白水比较均差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图1 不同剂量的罗哌卡因作用骨肉瘤细胞MG63 48 h后细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、P21蛋白表达

表1 不同剂量的罗哌卡因对骨肉瘤细胞MG63增殖的影响/（A值，）

表1 不同剂量的罗哌卡因对骨肉瘤细胞MG63增殖的影响/（A值，）

注：Con组为对照组，Ropivacaine-L组为低剂量罗哌卡因组，Ropivacaine-M组为中剂量罗哌卡因组，Ropivacaine-H组为高剂量罗哌卡因组。与Con组比较，aP＜0.05

72 h 1.46±0.14 1.36±0.13 0.75±0.07a 0.51±0.05a 175.544＜0.001组别Con组Ropivacaine-L组Ropivacaine-M组Ropivacaine-H组F值P值重复次数9 9 9 9吸光度（490 nm）24 h 0.55±0.05 0.47±0.04 0.36±0.03a 0.29±0.02a 88.611＜0.001 48 h 0.92±0.09 0.88±0.08 0.49±0.05a 0.34±0.03a 165.771＜0.001

图2 罗哌卡因中剂量对骨肉瘤细胞MG63凋亡蛋白表达的影响

2.3罗哌卡因对细胞MG63中miR-199b-5p表达的影响Con组、Ropivacaine-M组MG63细胞中miR-199b-5p表达水平分别为（0.82±0.08）、（0.13±0.01），且两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4抑制miR-199b-5p对细胞MG63增殖和凋亡的影响anti-miR-NC组MG63细胞吸光度、凋亡率及Cyclin D1、P21、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平分别为（0.98±0.09）、（7.66±0.75）%、（0.95±0.09）、（0.14±0.01）、（0.76±0.07）、（0.28±0.03），而 anti-miR-199b-5p组MG63细胞吸光度、凋亡率及Cyclin D1、P21、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平分别为（0.64±0.06）、（19.56±1.58）%、（0.40±0.04）、（0.53±0.05）、（0.36±0.03）、（0.71±0.07），两组比较各检测指标均差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 抑制miR-199b-5p对骨肉瘤细胞MG63增殖、凋亡蛋白表达的影响

2.5过表达miR-199b-5p能逆转罗哌卡因对细胞MG63增殖、凋亡的作用中剂量罗哌卡因+miRNC组MG63细胞吸光度、凋亡率及Cyclin D1、P21、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平分别为（0.36±0.03）、（23.35±2.34）%、（0.40±0.04）、（0.72±0.07）、（0.21±0.02）、（0.88±0.09），而中剂量罗哌卡因+miR-199b-5p组MG63细胞吸光度、凋亡率及Cyclin D1、P21、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平分别为（0.58±0.06）、（12.68±1.23）%、（0.71±0.07）、（0.37±0.03）、（0.53±0.05）、（0.57±0.06），两组各检测指标比较均差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 过表达miR-199b-5p能逆转罗哌卡因对骨肉瘤细胞MG63增殖、凋亡蛋白表达的影响

3 讨论

罗哌卡因是一种新型长效的局部麻醉药，具有作用时间长、对心脏毒性小、麻醉效果确切等优点，在临床麻醉手术中被广泛应用［13］。近几年的研究显示，麻醉药影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为，与肿瘤复发和转移密切相关［14］。王文婷［15］研究显示，罗哌卡因可抑制人结肠癌SW620细胞的增殖，并诱导其凋亡，发挥抗肿瘤作用。另有研究显示，罗哌卡因可呈剂量依赖性降低乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长和迁移能力［16］。夏明等［17］研究显示，罗哌卡因可能通过下调T细胞因子4（TCF-4）和 β-连环蛋白（β-catenin）表达水平降低人乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力。骨肉瘤多发于青少年，具有较高的病死率，严重威胁病人生命健康。细胞的异常增殖和凋亡是骨肉瘤发生发展的基础［18］，通过药物抑制骨肉瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，可改善骨肉瘤病人预后。目前，罗哌卡因对骨肉瘤增殖和凋亡的影响还未知。

Cyclin D1参与调控细胞周期，其表达增加可加速细胞增殖［19］。P21是目前公认的肿瘤抑制因子［20］。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax参与细胞的凋亡过程，Bcl-2蛋白表达降低或Bax蛋白表达升高可诱导细胞凋亡［21］。本研究结果显示，50、100µg/mL的罗哌卡因分别作用MG63细胞48、72 h后，MG63细胞增殖能力显著降低，Cyclin D1蛋白水平降低，而P21蛋白水平升高，但是20µg/mL的罗哌卡因作用MG63细胞后，MG63细胞增殖能力、Cyclin D1和P21蛋白水平差异无统计学意义，说明一定浓度的罗哌卡因可抑制MG63细胞增殖。本研究还显示，50µg/mL的罗哌卡因可提高MG63细胞凋亡率及Bax蛋白表达水平，降低Bcl-2蛋白水平，说明罗哌卡因可抑制骨肉瘤细胞增殖，并诱导其凋亡，是治疗骨肉瘤的潜在药物。

作为一种miRNA，miR-199b-5p在肝细胞癌、肾细胞癌和乳腺癌等肿瘤中呈低表达，作为抑癌基因参与这些肿瘤的发展过程［22-24］。杨澄等［25］研究显示，miR-199b-5p在骨肉瘤中高表达，是骨肉瘤诊断的潜在生物学标志物。但目前，miR-199b-5p对骨肉瘤细胞恶性行为的影响还未知。本研究显示，抑制miR-199b-5p表达降低了骨肉瘤细胞的增殖能力，并诱导了细胞凋亡，提示miR-199b-5p作为促癌基因促进骨肉瘤的发展进程，可能是骨肉瘤治疗的潜在分子靶点。本研究还显示，罗哌卡因降低了骨肉瘤细胞MG63中的miR-199b-5p表达，而过表达miR-199b-5p逆转了罗哌卡因对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用和凋亡促进作用，提示罗哌卡因通过下调miR-199b-5p表达来抑制骨肉瘤细胞的恶性行为。

综上，罗哌卡因可降低骨肉瘤细胞的增殖能力，并诱导细胞凋亡，机制可能与下调miR-199b-5p表达有关，具有治疗骨肉瘤的潜在价值。本研究还存在一定的不足之处，接下来将深入探讨miR-199b-5p下游靶基因及信号通路对骨肉瘤发生发展的影响，且进一步通过动物实验验证罗哌卡因能否调控miR-199b-5p信号通路影响骨肉瘤的发展进程。