源于间充质干细胞的外泌体与器官移植

孙东，宋红丽，沈中阳（.天津医科大学一中心临床学院，天津 3009；.天津市第一中心医院器官移植科，天津市器官移植重点实验室，天津市器官移植临床医学研究中心，卫生部危重病急救医学重点实验室，中国医学科学院移植医学重点实验室，天津 3009）

器官移植是20 世纪医学发展中最引人注目的成果之一，在本世纪又得到更快速的发展与更广阔的应用［1］。然而目前学科面临的如器官移植后免疫排斥反应、功能损伤等主要问题至今仍未得到满意的解决，是目前临床上桎梏器官移植学科发展的重要障碍。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一群具有自我更新能力、多向分化潜能的干细胞。其易于获得、来源丰富，具有强大的免疫调节、减轻组织器官损伤、促进组织修复、诱导新生血管生成等多方面生理学功能，是器官移植领域应用干细胞治疗的理想“种子细胞”［2］。但目前临床应用MSC 面临着如细胞来源与种类、干预的剂量、途径以及时机等方案的选择、移植后的安全性等诸多问题，制约了其临床应用。外泌体是MSC分泌的细胞介质，其发现不仅加深了对MSC 作用机制的认识，同时也为临床应用MSC 细胞治疗的方案提供了更为广阔的视野。我们对目前已经阐明的有关MSC 来源外泌体在不同细胞、组织、器官及系统水平上发挥调控功能的相关研究及其机制进行综述，旨在引起器官移植学者对MSC 来源外泌体的重视，为干细胞治疗在器官移植领域的应用提供新的观点及思路。

1 MSC 及其释放的外泌体

MSC 具有趋向于受伤部位进行组织修复、伤口愈合、免疫调节等功能，具有免疫豁免的特权，这是其在器官移植领域备受瞩目的主要原因之 一［3］。但是直接将MSC 作为干细胞治疗的工具仍然面临着众多风险。MSC 发挥功能主要依赖其旁分泌功能实现，而非通过定向分化形成新的细胞，其证据是目前MSC 移植后存活率及存活时间均有限，但其治疗效果却可以长期存在［4］。MSC 的旁分泌作用不仅局限于直接释放细胞因子，同样依赖于其释放的外泌体。外泌体中可以包含MSC 等细胞的蛋白质、DNA、信使RNA（mRNA）、微小RNA（MicroRNA，MiR）等细胞质内的多种具有生物学功能或信息传递功能的生物分子，是MSC 发挥作用的关键作用机制［5-6］。

2 MSC 外泌体作用的分子机制概述

外泌体作为细胞与细胞之间通讯的介质成分，以旁分泌、远距分泌的形式在细胞间传播生物信息，在生理及病理状态下发挥重要的调控作用［7］。MSC 外泌体内具有生物学活性的分子，如蛋白质、DNA、RNA 等成分与含量并非是作为一个特定静止的群体存在，而是会随着与细胞状态、培养环境、提取纯化步骤、细胞来源等多种条件的改变而呈动态变化。

非编码RNA 在体内发挥着重要的调控作用。一般根据序列长度将MSC 外泌体中的非编码RNA 大致分为MiR 和长非编码RNA（long-nocoding RNA，LncRNA）。外泌体的体积极小，序列较长的核酸及氨基酸组装成蛋白等往往难以完整保存，而MiR 因其长度多维持在20 ～24 个核酸之间，在外泌体中更有可能以完整的形式保存下来。因此，在MSC 外泌体的相关机制研究多围绕MiR 进行。据估计，MiR 参与调节的编码mRNA 翻译成的蛋白质约占30%左右，构成了真核生物转录组的基础。MiR 的以组织特异性方式表达，精确并积极地调节参与到细胞的各个过程，其经典调控机制为其在mRNA 转录后调节其基因表达水平，从而控制与细胞的发育、分化与其他相关的细胞命运密切相关的关键细胞途 径［8］。目前观点认为，MSC 外泌体中含有种类繁多的非编码RNA 在促进愈合与修复等多种作用效果中发挥着重要的调控机制。

2.1 调控干细胞多能性、分化特性：干细胞的分化和谱系决定依赖于遗传物质与分化细胞之间的双向相互交流与沟通，受到细胞周期转运与环境刺激的限制。干细胞来源的外泌体携带的遗传信息［9］。在其中，MSC 外泌体介导的遗传物质的交流与交换是干细胞生物学信息交换的重要机制，维持并促进了这种遗传物质的双向交换，对于维持干细胞本身的正常生理功能，维持细胞存活，调控胚胎及胚胎干细胞多能性、自我更新性与分化性能的平衡，并且在最终分化谱系的决定方面起着重要作用。例如，经MiR-486 修饰的干细胞外泌体可以将遗传信息携带至红白血病细胞中，使靶细胞内沉默信息调节因子-1 基因表达上调，从而诱导其向红细胞分化［10］。胚胎干细胞的外泌体同样可以将MicroRNA 及其他转录因子相关的mRNA 传递至靶细胞中，开启早期的向视网膜方向的分化程序［11］。MSC 的分化潜能远低于胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）及诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPScell），且移植入体内后其分化潜能及自我更新的能力明显减弱。因此，有观点认为MSC 发挥作用的方式更多依赖其免疫调节作用，而缺乏另一种重要的修复途径，即通过分化为特定细胞组织发挥修复损伤的作用，这很大程度上限制了MSC 的修复潜能。MSC 外泌体对干细胞多能性的调控作用或许可以从某一角度加深对MSC 分化潜能的理解，对维持MSC 的干性及调控其分化方向具有一定的意义［12］。

2.2 修复靶细胞器官组织：器官移植后，不可避免地出现移植器官的结构功能损伤。MSC 外泌体具有组织再生与器官保护等多项生物学作用。研究表明，MSC 及其来源的外泌体修复靶器官的作用围绕着多种机制，如调控靶细胞增殖、促进血管生成、抑制上皮间充质转化等［13］。

2.2.1 优化基质成分并抑制上皮间充质转化：基质中内皮细胞的增殖与激活是修复过程中的关键环节。MSC 外泌体可以激活基质中成纤维细胞合成胶原以优化基质成分，支持组织的修复与愈合。该过程的作用机制通过MSC 外泌体将携带的MiR-125a 传递至内皮细胞，通过下调血管生成抑制δ因子样4促进内皮细胞的增殖及血管生成［14］。此外，MSC 外泌体在伤口愈合期间通过抑制周边细胞内转化生长因子蛋白-β/SMAD 家族蛋白2（TGF-β/SMAD2）通路，抑制其向肌成纤维细胞方向分化，同时促进内皮细胞增殖及成纤维细胞活化［15］。

MSC 外泌体不仅调控内皮细胞与成纤维细胞的增殖与活化同时还可以抑制其上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程。成纤维细胞增殖可以促进基质重塑有助于组织修复，但是过量的成纤维细胞可能会导致组织增厚反而出现抑制修复过程的现象［16］。研究表明，使用MSC外泌体可以有效抑制TGF-β 处理过的近端肾小管上细胞E-钙粘蛋白的表达，缓解EMT 现象，从而有效保护肾脏功能［17］。在体内，骨髓MSC 外泌体同样可以抑制EMT 从而发挥修复作用，且在年轻肾脏中比老年肾脏中明显活跃，提示MSC 外泌体具有潜在的修复衰老肾脏纤维化的作用［18］。

2.2.2 抑制靶细胞组织凋亡：MSC 外泌体具有抑制靶细胞凋亡，促进靶细胞存活从而改善器官功能。例如，单独使用MSC 产生的外泌体可以将抗凋亡的MicroRNA 传递至受损的心肌细胞，继而在心肌细胞中转录，从而抑制受损心肌细胞中的促凋亡基因的表达，促进细胞存活，增强血管生成，最终改善心肌细胞的功能，且其保护作用甚至优于直接应用MSC 进行细胞治疗［19］。Wang 等［20］人进一步对不同MSC，如来源于骨髓内容物的MSC、来源于脂肪组织的间充质干细胞（adipose derived-MSC，AD-MSC）、来源于子宫内膜的间充质干细胞（endometrial MSC， EnMSC）对心脏的保护作用进行了比较，结果显示EnMSC 修复效果显著优于其他两种细胞，其原因在于EnMSC 外泌体中高表达的MiR-21 可能是其发挥抑制靶细胞凋亡的关键分子。MiR-181-5p 修饰的AD-MSC 通过外泌介导转移至受损的肝细胞，激活肝细胞内的自噬系统并下调信号传导及转录激活因子3、B 淋巴细胞瘤-2、纤粘蛋白、胶原蛋白Ⅰ、波形蛋白及α-平滑肌肌动蛋白等分子表现出肝脏保护作用［21］。总之，MSC 外泌体可以通过MicroRNA 传递遗传信息是MSC 发挥抑制凋亡的修复作用的重要机制之一。

2.2.3 促进靶细胞增殖：MSC 外泌体可以诱导靶细胞增殖，从而促进组织再生［22］。动物实验表明，来源自人滑膜MSC 的外泌体中丰富的MiR-140-5p 能够调节基质细胞的成脂肪方向/成骨方向的平衡，通过上调β-连环蛋白（β-catenin）/Wnt 通路，阻断基质成分分泌，促进基质细胞向软骨组织转化，有效预防大鼠膝关节炎的发生［23］。MiR-126是参与心肌细胞内糖酵解途径、支持心肌组织耐受缺氧应激的关键分子，而经葡萄糖处理过的MSC，其释放的外泌体中MiR-126 显著降低［24］。这不但解释了高糖条件或糖尿病患者体内MSC 修复血管内皮能力的降低，同时阐释了糖尿病患者冠心病发病率高、预后差的部分原因［25］。在常规治疗很难干预的神经组织中，MSC 外泌体中的MicroRNA 传递至神经细胞后也可以表现出神经保护功能以及促进神经再生的作用。AD-MSC 外泌体中的LncRNA转移相关肺腺癌转录-1 通过调节蛋白激酶Cδ Ⅱ剪接促进神经再生和增强的神经元存活［26］。更为有趣的是，衰老小鼠的下丘脑中干细胞、祖细胞大量丧失，而补充了年轻健康小鼠下丘脑中的干细胞的衰老小鼠，其衰老年龄与寿命显著延后，该过程中同样有脑脊液中的干细胞来源的外泌体中MicroRNA 与抗衰老因子的参与［27］。

2.3 免疫调节以提供理想的免疫微环境：免疫排斥反应是限制器官移植术预后的重要原因，也是亟待解决的难题。而MSC 的免疫调节功能是其备受器官移植专家青睐的重要原因。研究表明，炎症环境可以影响外泌体内蛋白、核酸等生物分子的特性及表达量，反之干细胞也可以借助外泌体传递MicroRNA 等遗传信息有效调控炎症反应的发 生［28］。例如脐带间充质干细胞来源的外泌体中含有 的MiR-21、MiR-146a、MiR-181 在 组 织 修 复过程中发挥免疫调节的作用［29］。使用炎性因子对MSC 进行预处理可以明显增强MSC 的免疫调节功能，同样体现在MSC 来源的外泌体中MicroRNA的 表 达 谱 上［30］。 例 如，MSC 对 白 介 素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的预处理后，其免疫调节功能得以激活。其后进一步影响巨噬细胞，导致巨噬细胞向M2 方向（即抗炎方向）极化，使得巨噬细胞抗炎性因素增强，促炎性因素减弱［31］。而这一现象可能与外泌体中的MiR-146a 显著上调有关。下调MiR-146a 的表达可以抑制IL-1β 预处理的MSC 外泌体的免疫调节作用［32］。这表明IL-1β 预处理的MSC 通过改变其外泌体中MiR-146a 的表达量增强其免疫调节功能。这为临床应用干细胞治疗提供了新的思路，即对MSC 的预处理后的免疫调节功能的增强与其分泌的外泌体直接相关。MSC 外泌体通过传递其内携带的MicroRNA等遗传信息，有效发挥其免疫调节功能，为组织修复过程提供理想的免疫微环境。

3 MSC 外泌体在器官移植领域的研究及前景

围绕器官移植的背景，美国内布拉斯加医学中心大学专家Mahato 等［33］率先将人骨髓间充质干细胞进行修饰，使其过表达可以抑制脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，Fas）表达的干扰RNA 及抑制MiR-375 表达的反义RNA。与外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）共培养过程中将外泌体传递至胰岛移植术后大鼠模型体内，显著下调了该大鼠体内Fas 及MiR-375 的表达水平，继而通过PBMC 增殖及增强调节性T 细胞功能，表现出显著的改善胰岛移植术后的免疫耐受状态的免疫调节功能。该研究表明在器官移植领域中，MSC 借助外泌体发挥出免疫调节的作用，有望成为该领域研究的热点方向。

目前，对MSC 外泌体直接应用于器官移植的研究尚不成熟。但现有的研究提示我们，MSC 在器官移植领域有着广阔的应用前景。以肝移植领域为例，MSC 外泌体具有的免疫调节、组织修复与促血管生成作用是其坚实的机制基础［34］。Lai 等［35］通过向发生移植物抗宿主病模型大鼠体内注射MSC 外泌体，可显著抑制Th-17 和Treg 细胞的活性，减轻免疫排斥反应及病理损伤。Jiang 等［36］的研究表明MSC 外泌体通过减少氧化应激、抑制肝细胞凋亡，减轻四氯化碳诱导的肝纤维化。此外，有研究表明将MSC 外泌体注射到肝癌小鼠体内时，借助其内丰富的抗肿瘤的MiR-122 等多种生物学分子，有效抑制肿瘤生长，提高化疗敏感性，说明MSC 外泌体可能特别适用于肝癌肝移植的患者［37］。

4 总 结

MSC 在器官移植领域的作用已经得到基础研究的证实并逐步推向临床，具有广阔的应用前景。与直接移植MSC 比较，外泌体的体积更小、结构更简单、稳定性更强，更易在统一标准下获取与保存，应用更为方便，有专家甚至提出了“cell-free therapy（无细胞参与）”的干细胞治疗策略。相信随着干细胞与临床医学专家对MSC 外泌体相关研究的深入，终将实现成熟的干细胞治疗方案，对器官移植事业的发展起到重要的促进作用。