基于纳米孔器件的光响应分子的应用

唐婧 王森 吴吉 梁丽媛 王亮 王德强

摘 要 探索生物大分子和小分子的构象以及它们在外界环境中的响应和作用规律对理解有机质的结构与性能的关系十分重要。纳米孔作为新兴的第三代单分子基因测序技术， 可以实时监测待测物分子的构象变化过程， 在单分子检测及核酸和蛋白测序方面展现了良好的应用前景。为了进一步提高检测的分辨率和精确度，可以采用光电联合检测方法，通过引入光响应分子以满足更高的检测需求。本文综述了目前纳米孔器件的研究进展以及代表性光响应分子在纳米孔检测系统中的设计与应用，主要介绍了偶氮苯及其衍生物、螺吡喃和二芳基乙烯三类光响应分子分别在生物孔和固态孔中的光响应性能。光调控是一种操作简捷有效的分子结构监控方式，其与纳米孔检测技术的结合在单分子识别方面的应用潜力对多功能纳米器件的设计与应用具有重要的指导意义。

关键词 纳米孔; 光调控; 生物传感器; 光响应分子; 结构反转; 评述

1 引 言

核酸是生命体的遗传物质，发挥着传递遗传信息、维持生命体进行正常生命活动的重要作用，充分了解核酸的结构信息和运行机制十分重要。DNA除双螺旋结构外，还存在其它二级结构，这些结构与某些癌症和遗传性疾病关联，所以相继出现了一些基于核酸二级结构的靶向治疗方法[1]。在活细胞中直接观察核酸的结构变化以及作用机制十分困难，纳米孔检测技术可以实时监测待测物分子的构象变化过程，具有单分子检测精度[2]，且检测范围广泛，包括小分子有机物[3]、纳米粒子[4]和生物分子聚合物[5]等。目前，按纳米孔载体材料不同可将纳米孔分为生物纳米孔和固态纳米孔，生物纳米孔通常是由蛋白质在磷脂双分子层上自组装成的通道结构，具有孔径和孔型稳定、可重复性好和信噪比高等优点，但是，由于支撑蛋白孔的磷脂双层的不稳定，使其使用寿命受到限制; 固态纳米孔孔径和孔型可控，环境耐受性强，易于实现孔表面的功能性组装及标记与修饰，但可重复性和信噪比不及生物纳米孔[6]。为了克服生物纳米孔和固态纳米孔各自的缺点， 并结合它们的优点，研究者诱导生物纳米孔在固态纳米孔中自组装制备杂化纳米孔[7]，使其具有高稳定性和可重复性; 另外DNA折纸技术的自组装特性和纳米级精确度也为杂化纳米孔的构建指明了方向[8]。

鉴于纳米孔自身的特性及纳米孔限域空间内电学信号检测精度对分析结果的影响[9]，采用光电联合检测方法可进一步提高检测灵敏度和精确度。光电联合检测方法将光调控与电化学分析相结合，在纳米器件表面或待测物分子上修饰光响应分子， 获得光诱导电信号[10，11]，从而进行待测物分析，或进行物质传输等[12]。光调节是一种精确、简单、可重复， 且光照时间、位置、强度都可调控的方法，有利于控制分子的运动和构象的变化[13]。近年来有很多报道关于光响应分子在纳米孔检测技术中的应用，以完成纳米孔自组装[14]，实现离子选择性传输[15]，控制纳米孔开关状态[16]，或者使待测物分子功能化[17，18]等。通过单一的光学检测技术实现单分子检测较为困难，因为目前光学传感体积无法控制在单分子级别，新型的等离激元纳米孔将等离激元和纳米孔检测两种传感模式相结合，同时提高了检测精确度和信噪比[19]。本文将主要介绍偶氮苯及其衍生物[20]、螺吡喃[21]和二芳基乙烯[22]三类不同的光响应分子的光响应机制以及它们在光控纳米孔器件中的应用。

2 偶氮苯及其衍生物在光响应体系中的应用

偶氮苯及其衍生物是一种常用的光敏开关，紫外光下呈现为顺式构象（cis-azo），切换可见光，则呈现为反式构象（trans-azo），且此过程可逆（图1）。偶氮苯衍生物可以通过聚酰胺修饰在DNA双链的小凹槽上[23]，平面的trans-azo与DNA碱基对之间通过π-π堆叠作用稳定双链，而cis-azo会使双链DNA解链[24，25]。据此，研究者做了很多探索，如光调控生物分子在多通道纳米器件上的自组装[26]，以及适配体探针的修饰，不同光照条件下两种不同结构的适配体探针与目标物之间的亲和力差异有助于阐释适配体与目标物之间的相互作用，在靶向药物传递和光动力治疗中具有广阔的应用前景[27]。体外控制DNA的解链和杂交是DNA纳米技术的重要步骤，可通过调节温度实现，若利用光调控， 则需要使DNA序列功能化，而偶氮苯衍生物可与DNA序列发生非共价作用，凭借平面反式构象稳定DNA双链，在紫外光和可见光的调控下实现DNA双链可逆的解链与杂交[28]，在恒定温度条件下， 可逆地控制DNA纳米结构的组装与拆分，这有望成为光调控DNA纳米技术的一种新方法。

环糊精（CD）和葫芦脲（CB[n]）可作为偶氮苯及其衍生物的主体分子[35，36]。生物系统中离子通道的开关状态受配体、pH值及电位等因素的影响，对于体外实验，单分子级别的人为调控对实验条件要求较高，而在纳米孔中引入光响应分子有望实现这一目标，并且在纳米阵列中亦有很大的应用潜力。固态纳米孔结构稳定，易于进行表面功能化， 以优化性能[37]。 Xie等[38]通过在聚酰亚胺（PI）纳米孔表面修饰偶氮苯调控纳米孔的开关状态（图2），利用偶氮苯与β-环糊精（β-CD）的主客体反应，改变纳米孔表面的亲疏水性，从而使纳米孔在非导电和导电状态之间切换。该系统不仅具有光响应性，还具有电压调控性，当非导电纳米孔两侧的电压达到极限值（2.6 V）时，纳米孔切换为导电状态，该模型特有的光响应性和电压调控性有助于研究和操纵纳米约束环境下的水行为。此外，纳米孔器件的功能化常受到分子马达的启发，如在可见光作用下，细菌视紫红质质子泵系统将质子从细胞质转移到细胞外，完成跨膜运输（图3A）。Xie等[39]模拟该生物质子泵设计了一个仿生光驱动大通量运输系统（图3B），修饰有偶氮苯的PI纳米孔经光调控使表面亲疏水性发生变化，处于纳米孔限域空间的偶氮基团在可见光和紫外光的循环照射下，构象连续反转，将积累在通道中的分子排出，其疏水性只允许β-CD通過纳米孔，所展现的高选择性在药物传递中有潜在的应用价值。除了将偶氮苯修饰在纳米孔表面外，Liu等[40]在PI纳米孔内修饰了β-CD，制备了基于主客体系的光调控纳米流体二极管（图4），通过调节pH值实现高精度整流，具有不同表面性质和状态的纳米通道为光敏纳米流体器件和药物传输与释放提供了一个新的纳米流体平台。

此外，视觉感受器视紫红质中的视网膜成分也具有光响应性，经光线触发， 11-cis-视网膜将转化为全trans-视网膜，将光转化为电信号，在生物离子通道的形成过程中发挥着重要作用[41]。受该通道启发，Shi等[42]基于氧化石墨烯（GO）和偶氮苯之间的相互作用，设计了人工光敏离子栅门，在含有微小传导通道的多孔阳极氧化铝（PAA）膜上修饰azo-DNA， 在紫外光照射下，cis-azo的空间位阻使ssDNA序列趋于伸展， 暴露在外的cis-azo与GO发生π-π堆叠作用，此时覆盖在PAA膜上的GO阻止了离子传输; 而在可见光照射下， 平面trans-azo使ssDNA折叠为双螺旋结构，trans-azo被包裹在dsDNA内部，表面的GO脱落，离子通道打开（图5），光调控使该离子栅门具有高效切换离子通道开关状态的能力，并且生物相容性和通用性良好，在光学传感器、光电转换和可控药物释放等方面具有很好的应用前景。α-溶血素（α-HL）纳米孔是目前最广泛使用的生物纳米通道之一，可检测多肽的结构[43]，或探索dsDNA碱基的质子化机理[44]等。在光敏DNA（azo-dsDNA）序列的检测中表现出优异的性能（图6A），不同的光照条件下，α-HL纳米孔可识别azo-dsDNA混合物中两种不同构象的分子（图6B）[17]，与cis-azo-dsDNA通过α-HL纳米孔时产生的阻塞时间（（0.52±0.01） ms， +80 mV）相比，trans-azo-dsDNA的阻塞时间更长（（807±0.36） ms， +80 mV），这是因为trans-azo对DNA双链的稳定作用导致解链需要更长的时间，DNA双链的解链动力学不仅可以证实trans-azo对dsDNA的稳定作用，还可以精准获得azo-dsDNA的结构状态; 光敏DNA在纳米孔中的应用提高了纳米孔的分辨率，使得生物传感器对异构体的识别达到了单分子水平。

气单胞菌溶素（AeL）是另一种在单碱基检测中具有高灵敏性的生物纳米孔，但是野生型气单胞菌溶素纳米孔（WT-AeL）只能区分2～10个碱基的单链寡核苷酸[3，45]，利用阳离子调控机制可检测30个碱基[46]。AeL纳米孔对修饰有偶氮苯的光敏DNA（azo-ssDNA）的检测具有超高的时空分辨率（图7）[18]，与α-HL纳米孔相似，它可以识别azo-ssDNA混合物中两种不同构象的分子， trans-azo的空间位阻使azo-ssDNA在孔内的易位速度减慢，产生的阻塞时间约是cis-azo-ssDNA的3.3倍，AeL纳米孔可以准确监测每个azo-ssDNA分子的过孔状态，定量检测cis/trans混合构型中各自的比例[47]，并且光调控可以实现azo-ssDNA在两种构象之间的可逆转换，这有助于加深对azo-ssDNA光转换特性的理解，纳米孔提供的纳米界面不仅为单分子器件的应用提供了平台，也对描述相关光可控生物过程和光燃料器件中的光调控活性、效率和机制具有指导意义。

Fragaceatoxin C（FraC）是一种来自Actinoporins蛋白的毒素，可在富含鞘磷脂受体的细胞表面自组装为α-螺旋纳米通道[48]，内部收缩区仅为1.2 nm，但与α-HL和AeL纳米孔不同的是，在高电位下，FraC 纳米孔α-螺旋跨膜区的形变允许dsDNA易位[49]。FraC纳米孔可调节孔径，这使其可以识别溶液中单个肽的质量，并且对蛋白质进行实时测序，可用于生物样品的蛋白质组学表征[50，51]。光响应分子的引入可以指导FraC在脂质双层膜上的自组装，Mutter等[14]在FraC（azo-FraC）與鞘磷脂的结合位点附近的不同位置修饰了偶氮苯衍生物，以光作为外部触发因素，可逆地控制FraC在脂质双层膜上的聚集，在紫外光照射下， cis-azo指导FraC与鞘磷脂的结合，甚至可以取代鞘磷脂使FraC在细胞膜上形成纳米通道; 而在可见光照射下， FraC失活（图8），这种光激活FraC可作用于多种富含鞘磷脂的真核细胞，在光激活肿瘤治疗中具有应用潜力，可控制非活性毒素在照射肿瘤部位局部激活，用白光照射肿瘤周围的区域使其再次失活，并且光调控纳米孔自组装的能力也为降低纳米孔阵列制造的复杂性提供了参考。

3 其它光响应分子的应用

螺吡喃及其衍生物也是广泛使用的光致变色分子，在紫外光照射下，封闭形态的螺吡喃（SP）转化为开环形态的花青素（MC），经加热或可见光照射，MC转化为SP（图9）[52]。螺吡喃分子的光异构化过程不仅是简单的立体异构化，而且还诱导了化学结构和物理性质的改变，与SP相比，MC是π-π共轭的极性更大的两性离子，由此产生的光磁效应可用于制备光致变色的室温铁磁材料[53]，在纳米纤维/聚二甲基硅氧烷复合材料应用中，分子颜色的改变使该材料具有机械变色性，可实现定向应力和应变的检测[54]，以及可逆地调控纳米探针的荧光性[55]。螺吡喃及其衍生物在碳纳米管（CNTs）中应用广泛，如制备可光固化的CNTs[56]，或作为偶极开关调控碳纳米管的发射响应[57]等。此外，若将手性基团共价连接到螺吡喃上，螺吡喃的光异构化会引起手性信号的变化，将两种螺吡喃对映体引入谷氨酸超分子凝胶，在紫外光和可见光交替照射下，凝胶中的螺吡喃在两性离子MC和SP之间转换，自组装凝胶也会在螺旋型和纤维型之间可逆变化[58]。螺吡喃在异构化过程中亲水性的变化可用于调控纳米孔的开关状态[16]，如图10所示，螺吡喃经聚乙二醇（PEG） 共价修饰在锥形纳米孔表面（PEG-SP），在紫外光照射下，SP转变为可溶于水的MC，此时PEG链采用能量更低的折叠构象，使纳米孔打开; 在可见光照射下，不溶于水的SP使PEG趋于伸展，纳米孔关闭，光调控赋予了纳米孔可逆的门控特性。

二芳基乙烯及其衍生物（DAEs）是另一类光响应分子，DAEs含有两个芳香基团，通过烯烃键相连，经光调控发生开环和闭环的异构化过程，图11为典型的全氟环戊烯衍生物的光致异构化过程示意图[59]，其衍生物的光响应性质受开环异构体、取代基的构象、异芳基的共轭长度和乙烯桥的性质等因素的影响[60]。

DAEs是最抗疲勞的光致变色化合物之一[61]，经DAEs功能化的荧光探针可以作为光学纳米镜的生物标记物，不仅可提高光学纳米镜的分辨率，而且不需要任何成像介质添加剂即可实现可逆的光敏调控[62]。除此之外，DAEs可改性石墨烯电极，以提高石墨烯电极的精确度、稳定性和可重复性，且具有可逆的电导和光效应[63]。DAEs常用于可光调控的多孔材料中， 作为气体储存和分离的吸附剂，如金属有机骨架（MOFs），DAEs在MOF内的集成使其具有光响应特性，可实现高效碳捕获，且光驱动DAEs基元的局部异构化不会引起MOF骨架内的整体改变[60]。Fan等[64]制备了以DAEs为基元的金属有机骨架（DAE-MOF），首次分离了C2H2/C2H4混合气体，可见光下DAEs的开环异构化使其可以与C2H2/C2H4发生主客体反应，由于C2H2与DAEs分子之间的主客体相互作用力更强，DAE-MOF可以高选择性的分离出混合气体中的C2H2，紫外光下处于闭环结构的DAE-MOF无法分离混合气体。此外，DAEs也用于生物研究中所需的人工纳米结构的改性， Mi等[65] 设计合成了一种可精确控制单重态氧（1O2）生成的光敏系统，1O2在光动力治疗的细胞杀伤机制中起着至关重要的作用[66]，该系统中1O2的生成活性可被近红外光照射远程激活。如图12所示，掺杂镧的上转换纳米颗粒（UCNP）作为纳米结构的核，而修饰有卟啉PSs的介孔二氧化硅（MSN）作为壳，在没有光响应分子DAE时，在980 nm 近红外光照射下，UCNPs的可见上转换发光与PSs的宽吸收光谱有很好的重叠，可将能量转移到PS，从而高效生成1O2; 若将光响应分子DAE放置在靠近PSs的纳米孔中，介孔中的DAE处于闭环状态时会阻止1O2的生成，在808 nm光照射下，DAE转化为开环结构，打开了生成1O2的通道，而紫外光照时DAE发生结构反转，实现通道的可逆调控。

4 总 结

本文评述了纳米孔单分子检测技术的发展现状，包括生物纳米孔和固态纳米孔在鉴别生物分子构象及动态监测方面的应用; 重点介绍了偶氮苯及其衍生物、螺吡喃和二芳基乙烯这三类具有不同光致响应调控机制的光开关分子在不同核酸结构体系、纳米器件与多孔材料中的体系设计与分子调控效应。 联合光电化学、有机合成及材料加工等技术，可设计出更多性能优异的光响应纳米器件，应用于生物医学与材料领域。目前，还有很多技术问题有待解决，包括一些光响应分子在生物体系中的相容性与稳定性，外加光源与体系的兼容与干扰等。光响应纳米系统有望应用于体内诊疗，而光调控方法与纳米孔检测技术的结合在单分子识别方面的潜力也为纳米器件的设计提供了新思路。

References

1 Neidle S， Read M A. Biopolymers，  2000， 56（3）： 195-208

2 Venkatesan B M， Bashir R. Nat. Nanotechnol.，  2011，  6（10）： 615-624

3 Piguet F， Ouldali H， Pastoriza-Gallego M， Manivet P， Pelta J， Oukhaled A. Nat. Commun.，  2018，  9（1）： 966

4 Gao R， Ying Y L， Li Y J， Hu Y X， Yu R J， Lin Y， Long Y T. Angew. Chem. Int. Ed.，  2018，  57（4）： 1011-1015

5 Jain M， Koren S， Miga K H， Quick J， Rand A C， Sasani T A， Tyson J R， Beggs A D， Dilthey A T， Fiddes I T， Malla S， Marriott H， Nieto T， O'Grady J， Olsen H E， Pedersen B S， Rhie A， Richardson H， Quinlan A R， Snutch T P. Nat. Biotechnol.，  2018，  36（4）： 338-345

6 Ding T L， Yang J， Pan V， Zhao N， Lu Z H， Ke Y G， Zhang C. Nucleic Acids Res.，  2020，  48（6）： 2791-2806

7 Hall A R， Scott A， Rotem D， Mehta K K， Bayley H， Dekker C. Nat. Nanotechnol.，  2010，  5（12）： 874-877

8 Farimani A B， Dibaeinia P， Aluru N R. ACS Appl. Mater. Interfaces，  2017，  9（1）： 92-100

9 Ying Y L， Long Y T. Sci. China Chem.，  2017，  60（9）： 1187-1190

10 Pang H， Xu P P， Li C L， Zhan Y B， Zhang Z Y， Zhang W S， Yang G F， Sun Y， Li H B. Chem. Commun.，  2018，  54（24）： 2978-2981

11 Wang J， Song Q T， Guo X G， Cui X， Tan L X， Dong L C. Anal. Chem.，  2019，  91（22）： 14530-14537