炎调方调控HMGB1通路对脓毒症急性肺损伤大鼠线粒体功能的保护作用研究∗

吕弈宾 陈 乾 熊旭东 谢 芳 李淑芳

（上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203）

脓毒症是由于过度的促炎介质引发，从而导致促炎/抑炎失衡的器官功能障碍性综合征[1]，该病是重症监护病房发病率最高和死亡率最高的疾病之一[2-3]。由于脓毒症发病机制极为复杂，具体机制仍未明确，但大量研究表明高迁移率族蛋白1（HMGB1）与炎症因子水平、疾病严重程度及脓毒症预后呈正相关[4]。脓毒症发生后24 h内，存在于免疫细胞、内皮细胞和上皮细胞细胞核中的主要警报蛋白——HMGB1，被组织激活并释放，与多种靶细胞受体相互作用[5-6]，从而促进促炎细胞趋化因子的释放，导致线粒体功能激活[5]，过度促进氧化因子发生氧化反应，进而损伤机体组织损伤。随着HMGB1促炎信号逐渐增强，线粒体功能损伤更为严重，甚至导致线粒体发生障碍，加重脓毒症炎症反应。此外，因线粒体功能极为强大，已被证实与严重脓毒症诱导的死亡密切相关[7-9]。熊旭东教授课题组经过多年临床和基础实验，制定出炎调方用于治疗脓毒症急性肺损伤。基础研究表明炎调方能够减轻脓毒症致急性肺损伤（ALI）大鼠炎症介质释放，降低氧化应激反应，具有保护肺组织的作用[10-11]。临床研究显示，炎调方能够减轻脓毒症ALI患者的炎症反应，提高患者氧合水平[12]。本实验拟通过观察炎调方对HMGB1表达的影响，探讨其对线粒体的作用，为进一步探索炎调方治疗脓毒症致ALI的作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

40只清洁级SD成年雄性大鼠，体质量（200±20）g，由上海中医药大学动物实验中心提供。饲养条件：室温22～24℃，相对湿度40%～60%。每笼5只，自由饮水，进食普通标准饲料，每天7∶00～19∶00予以光照，适应性饲养1周后进行试验。

1.2 试剂与药物

炎调方免煎剂，组成：生大黄6 g，芒硝10 g，桃仁12 g，赤芍15 g，玄参12 g，当归12 g，银花15 g，连翘15 g，麦冬12 g。产品批号：1809310，由上海中医药大学附属曙光医院提供。参考文献[13]体表面积折算，动物灌胃体积为1 mL/100 g。乌司他丁（广东天普生化医药股份有限公司生产，国药准字H19990134）、线粒体Na+-K+-ATP酶活性试剂盒（南京建成科技有限公司生产，产品批号2018005）、线粒体Ca2+-ATP酶活性试剂盒（南京建成科技有限公司生产，产品批号2018005）、戊巴比妥钠（上海伊卡生物科技有限公司生产，产品批号 2017012）、戊二醛（sigma-alorich生产，产品批号2017005）、磷酸缓冲液（国药集团化学试剂有限公司生产，产品批号2017005）。

1.3 实验仪器

HH-2数显恒温水浴锅（江苏荣华仪器制造有限公司）、721型分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）、高速离心机（Eppendorf centrifuge 5415D）、101数显鼓风干燥箱（上海叶拓仪器仪表有限公司）。

1.4 造模与给药

将SD雄性大鼠40只随机分为假手术组、模型组、炎调方组和乌司他丁组，每组10只。模型组于造模前予生理盐水10 mL/kg灌胃，每天1次，第3次灌胃2 h后行盲肠结扎穿孔术（CLP）术造模[10]：大鼠经2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，在腹正中作一1.5 cm长的切口，找到盲肠，在其根部结扎，用18号针穿通3次，轻挤出少量肠内容物，留置2 mm皮瓣防止针孔闭合，还纳盲肠于腹腔，逐层缝合腹壁切口，术毕皮下注射生理盐水30 mL/kg抗休克。假手术组麻醉后仅开腹翻动肠道，关腹，其余操作同模型组。模型组与假手术组术后腹腔注入生理盐水10 mL/kg。炎调方组于造模前给予炎调方免煎颗粒灌胃，每天1次，第3次灌胃2 h后行CLP术造模，术毕腹腔注射生理盐水10 mL/kg。乌司他丁组于造模前生理盐水10 mL/kg灌胃，每天1次，第3次灌胃2 h后行CLP术造模，术毕腹腔注射乌司他丁10万U/kg。各组灌胃时间均为早上7点开始，按假手术组、模型组、炎调方组和乌司他丁组依次灌胃。

1.5 标本采集与检测

40只大鼠于造模后24 h取材（取材当天不灌胃），麻醉后沿缝合切口打开腹腔，暴露后腹膜，用10 mL注射器抽取腹主动脉血，存于采血管中，室温静置2 h后离心（3 000 r/min，10 min）取上清。打开胸腔，取左肺组织保存于空EP管中，右肺组织保存于含4%多聚甲醛EP管中。

1.5.1 透射电子显微镜观察线粒体超微结构 从4%多聚甲醛中取出右肺组织，用戊二醛、磷酸缓冲液固定，脱水、包埋、固化、并切片，并用3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，使用JEOL JEM-1230（80KV）观察，拍片。

1.5.2 HE染色观察右肺组织 从4%多聚甲醛中取右肺组织，用不同浓度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片、脱蜡后用苏木素及伊红染色，封片后在光学显微镜下观察、拍照。

1.5.3 线粒体Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶测定

取左上肺组织剪碎、匀浆、离心（5 000 r/min，10 min）后取上清，通过酶联免疫测定的方法检测ATP酶分解产生的无机磷的光密度来测定肺组织中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。

1.5.4 肺组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量的测定 采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量。

1.5.5 RT-PCR检测肺组织HMGB1 mRNA表达水平采用TRIzol法，氯仿异丙醇抽提约100 mg左肺组织RNA，并检测RNA浓度，根据反转录试剂盒说明书将RNA转录制备cDNA。将制备好cDNA进行real-time PCR 扩增，HMGB1上游引物5′-TAGCTAGCCCTGTCCTGGTG-3′，下游引物5′-TGTGCACCAACAAG AACCTG-3′，扩增产物的长度108 bp。GAPDH内参对照，上游引物5′-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3′，下游引物 5′-ACTGTGGTCATGAGCCCTTC-3′，扩增长度135 bp。实时荧光定量PCR的反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性15 s、60℃退火，延伸45 s，40个循环；95℃，15 s 60℃，15 s熔解曲线分析。反应结束后记录所得扩增曲线的Ct值，2-ΔΔCt法计算所得结果。

1.6 统计学处理

应用SPSS24.0对数据进行录入并进行统计。数据均以（）表示，采用One-way ANOVA进行分析，多组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异具有统计学差异，P＜0.01表示有显著统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况观察

与假手术组比较，模型组大鼠术后精神差，灵敏度及活动度下降，毛发竖立，呼吸频率增快，腹部膨隆，无大便。经治疗后，炎调方组及乌司他丁组大鼠精神状态、灵敏度、活动度较模型组改善，但二者之间无明显差异。开胸后模型组大鼠肺组织可见水肿、瘀斑、瘀点，部分肺组织颜色黯红，炎调方组和乌司他丁组大鼠肺组织损伤程度较模型组好转，二者之间无明显差异。

2.2 各组大鼠肺组织损伤情况

见图1。假手术组肺组织结构相对完整，肺组织形态相对正常，肺泡腔清晰可见，肺间质出现轻度水肿及炎症等病理变化；而模型组可见肺组织结构明显破坏，肺间质水肿，炎症细胞满布，肺组织中肺泡数量减少；与模型组比较，炎调方组和乌司他丁组肺组织结构损伤破坏程度低，炎症细胞、肺组织水肿程度要轻，但二者之间比较没有明显差异。

2.3 各组大鼠肺组织线粒体超微结构

见图2。假手术组可见线粒体大小无改变，数量较多，内外膜完整无损伤，嵴排列较为整齐；与假手术组相比，模型组可见线粒体数量明显减少，体积变大，嵴断裂脱落甚至出现空泡化，内外膜出现破损；与模型组比较，炎调方组和乌司他丁组线粒体损伤程度要轻，但二者无明显差别。

图2 各组大鼠肺组织电镜下线粒体（10 000倍）

2.4 各组大鼠线粒体Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶比较

见表1。与假手术组相比，模型组、炎调方组和乌司他丁组的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显下降（P＜0.01）；炎调方组Na+-K+-ATP酶活性有所回升（P＜0.01），但Ca2+-Mg2+-ATP酶活性与模型组相比无统计学意义（P＞0.05），乌司他丁组的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性较模型组有所回升（P＜0.01），但与炎调方组比较无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠ATP酶活性比较[μmol/（h·mg），±s]

表1 各组大鼠ATP酶活性比较[μmol/（h·mg），±s]

与假手术组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。下同

Ca2+-Mg2+-ATP酶5.32±0.55 2.31±0.24△△2.91±0.73△△3.17±0.54△△**组别假手术组模型组炎调方组乌司他丁组n 10 10 10 10 Na+-K+-ATP酶5.47±0.69 2.35±0.60△△3.51±0.42△△**3.62±0.57△△**

2.5 各组大鼠肺组织中SOD活性及MDA含量比较

见表2。与假手术组相比较，模型组的SOD活性下降（P＜0.01），MDA含量上升（P＜0.01）；炎调方组和乌司他丁组的SOD活性较模型组明显上升（P＜0.01），MDA含量明显下降（P＜0.01），其中乌司他丁组的SOD含量较炎调方组上升（P＜0.05），而MDA含量比炎调方组要低（P＜0.01）。

表2 各组大鼠肺组织中SOD活性及MDA含量比较（U/mg，±s）

表2 各组大鼠肺组织中SOD活性及MDA含量比较（U/mg，±s）

与炎调方组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下同

组别假手术组模型组炎调方组乌司他丁组MDA 0.63±0.09 2.28±0.28△△**1.59±0.20△△**1.24±0.17△△**▲▲n 10 10 10 10 SOD 110.69±10.71 48.18±7.87△△64.39±6.34△△**73.79±5.40△△**▲

2.6 各组大鼠HMGB1 mRNA表达水平比较

见表3。与假手术组比较，模型组的HMGB1 mRNA表达水平明显上升（P＜0.01）；炎调方组和乌司他丁组HMGB1 mRNA的表达水平较模型组降低（P＜0.05），且乌司他丁组较炎调方组下降（P＜0.05）。

表3 各组大鼠HMGB1 mRNA表达水平比较（%，±s）

表3 各组大鼠HMGB1 mRNA表达水平比较（%，±s）

组别假手术组模型组炎调方组乌司他丁组n 10 10 10 10 HMGB1 mRNA 1.66±0.39 6.99±1.32△△5.47±1.06△△*4.05±0.96△△**▲

3 讨 论

脓毒症是由于机体对感染所引发免疫炎症失衡的器官功能障碍综合征[1]，肺损伤是其最常见并发症[2]。基于病原微生物理论[14]，最初认为宿主对病原体的应答主要是通过病原相关分子模式和模式识别受体的相互作用来实现。随着研究进展，研究者还发现模式识别受体不仅能够被病原微生物激活，也能够被损伤相关分子模式激活（DAMPs）[15]。DAMPs是宿主细胞核或细胞质的非微生物分子，例如HMGB1和组蛋白[16-17]，当组织损伤时释放入细胞外，启动和维持非感染性炎症反应，导致全身炎症、器官损伤和死亡。HMGB1是所有哺乳动物细胞中高度保守的蛋白，可以通过细胞质囊泡主动释放，也可以被动地从坏死细胞释放。一旦释放到细胞外，HMGB1能够通过RAGE[5]和TLR4[6]等结合，激活先天免疫细胞，促进活性氧过量产生，诱导中性粒细胞募集到组织损伤部位，增强炎症反应和氧化应激反应，导致线粒体功能障碍，进而调节微循环血流动力学变化，从而促进感染性休克发生[18]。线粒体损伤在脓毒症患者中较为常见，线粒体损伤的严重程度与炎症因子水平、疾病严重程度、预后呈正相关[9]。线粒体功能障碍通过以下机制参与了脓毒症诱导的多脏器功能衰竭：1）引起细胞内凋亡，导致免疫抑制[8]；2）导致细胞能量代谢紊乱[7]；3）参与全身炎症反应的发生[19]。线粒体功能障碍与HMGB1可相互作用。现有研究表明，随着脓毒症的加重，NADPH氧化酶和线粒体功能障碍等来源产生的ROS增加，能够促进HMGB1的氧化，进而导致HMGB1的促炎信号增强[4]。另外，线粒体功能障碍后除了释放ROS，还可以释放内生警报信号mtDNA引起先天免疫系统通过多种信号转导途径，诱导巨噬细胞NLRP3炎症小体活化，调控IL-1和IL-8产生及释放[20]。

脓毒症ALI在中医里并无相应病名，根据其症状、疾病演变，可归于“热病”“温病”中“喘证”“暴喘”范畴。根据脓毒症临床主要以气喘、烦渴、身热、腹胀便秘为主症，熊旭东教授课题组自拟炎调方以通腑活血、泻热存阴为大法，旨在清除脓毒症致ALI中炎症介质。基础研究[10-11]发现炎调方能够降低脓毒症ALI大鼠的NF-κB水平，上调HSP70表达，有效减轻脓毒症ALI大鼠的氧化应激反应及炎症反应作用，防止脓毒症ALI大鼠肺组织损伤；临床研究[12]同样发现炎调方能够减轻脓毒症ALI患者血清IL-2、IL-6和IL-8水平，有效改善患者氧合水平，缩短脓毒症ALI患者机械通气时间。脓毒症ALI患者由于外感六淫，营热毒邪炽盛，常常易于伤阴，而且临床可见此类患者阴亏明显，我们遂在炎调方中加入金银花、连翘、麦冬，助臣药赤芍、玄参达清营热滋阴之效。同样，经改良后炎调方[21]也能够降低脓毒症ALI大鼠肺组织Fas蛋白表达，抑制TNF-α水平，有效防止脓毒症肺组织损伤。

本实验拟从线粒体结构及功能入手，进一步探索炎调方保护脓毒症ALI机制。研究发现，在一般情况下肺组织HE染色、线粒体超微结构显示，炎调方组要优于模型组。由于线粒体的两大功能作用——供能及氧化应激，笔者观察各组的线粒体ATP酶及氧化应激反应水平，发现脓毒症时线粒体ATP酶下降，用药处理后，炎调方能提升Na+-K+-ATP酶活性。表明炎调方有保护线粒体维持正常功能的作用；在氧化应激反应方面，造模后模型组的SOD下降明显、MDA上升明显，而与模型组相比，炎调方具有上调SOD活性和下调MDA含量的作用，表明炎调方具有减轻氧化应激反应的作用。为进一步探索作用机制，我们观察各组HMGB1 mRNA水平，发现炎调方有下调HMGB1 mRNA作用。因此，基于以上结果，本研究显示炎调方能通过下调HMGB1表达水平，防止线粒体进一步损伤，从而达到有效减轻脓毒症ALI大鼠肺组织损伤的作用。