双波长高效液相色谱法同时测定乌蕨中6种主要活性成分含量

陈明，段萍，徐作刚，万红才，刘晓艳

(1.黔南民族医学高等专科学校基础医学部药理学教研室，都匀 558000；2.黔南州检验检测院食品药品检验所化学室，都匀 558000)

乌蕨[Stenolomachusanum(L.) Ching.]为鳞始蕨科乌蕨属的多年生草本植物，又名大叶金花草、乌韭等，在我国主要分布于长江流域以南各省份。从20世纪60年代开始，国内外即有学者对乌蕨的主要成分、药理作用、临床应用等方面进行研究。乌蕨植物资源丰富，在医药、畜牧兽医、化妆品、园艺栽培等领域均有较大的开发利用价值。其内服治疗感冒发热、咳嗽、扁桃体炎、腮腺炎、肠炎、痢疾、肝炎、肾炎、食物中毒、农药中毒等；外用可治烧伤、烫伤、皮肤湿疹，近期报道乌蕨还具有降血糖、抗肿瘤的作用[1-5]。乌蕨具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗酪氨酸酶等生物活性，主要与其含有的黄酮类(荭草苷、荭草苷-2-0-B-D-吡喃葡萄糖苷、牡荆素、牡荆素鼠李糖苷、木犀草苷、芹菜素、山柰酚等)，酚酸类(原儿茶酸、原儿茶醛、香草酸、丁香酸等)等化学成分有关[6-7]。根据文献[8-12]，目前主要采用紫外分光光度法测定乌蕨中总黄酮量；有部分研究采用高效液相色谱(HPLC)法同时测定其1～2种活性成分，但同时测定乌蕨中原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷、牡荆素、牡荆素鼠李糖苷、木犀草苷6种活性成分含量的方法笔者未见报道。本研究建立了HPLC同时测定乌蕨中原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷、牡荆素、牡荆素鼠李糖苷、木犀草苷6种活性成分含量的方法，并采集了24个乌蕨样本进行检测。报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1260 DAD VL高效液相色谱仪，DAD紫外检测器，美国安捷伦科技有限公司；Ultimate 3000高效液相色谱仪，DAD紫外检测器，美国赛默飞世尔科技公司；赛默飞(Thermo)A型C18(5.0 mm×250 mm，5 μm)色谱柱； Mettler AG 135(感量：0.01 mg)、AL204电子天平(感量：0.1 mg)，瑞士梅特勒-托利多公司；SK250LHC超声波清洗器，上海科导仪器有限公司。

1.2试药 原儿茶酸对照品(批号：110809-201205，含量99.9%)，原儿茶醛对照品(批号：110810-200205，含量100.0%)，荭草苷对照品(批号：111777-201302，含量97.9%)，牡荆素鼠李糖苷对照品(批号：111668-200602，含量100.0%)，牡荆素对照品(批号：111687-201603，含量95.7%)，木犀草苷对照品(批号：111720-201106，含量99.3%)，均购于中国食品药品检定研究院；乙腈(天津科密欧化学试剂有限公司色谱纯、分析纯)；娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

本实验采集到不同批次的乌蕨24批，经贵阳中医学院何顺志教授鉴定为鳞始蕨科乌蕨属Stenolomachusanum(L.)Ching.的干燥品。采割地上部分晾干，粉碎，过三号筛，置干燥器中保存，备用。

2 方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1对照品溶液制备 精密称取荭草苷21.33 mg、牡荆素鼠李糖苷24.84 mg、木犀草苷16.53 mg分别置50 mL量瓶中，原儿茶醛10.62 mg、牡荆素20.33 mg分别置100 mL量瓶中，原儿茶酸10.13 mg置25 mL量瓶中，分别加65%乙醇超声溶解，放冷，加65%乙醇至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取储备液加65%乙醇制成每毫升含原儿茶酸0.080 96 mg、原儿茶醛0.031 86 mg、荭草苷0.041 76 mg、牡荆素鼠李糖苷 0.119 2 mg、木犀草苷 0.013 13 mg、牡荆素0.038 91 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备[11]乌蕨粉末约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入65%乙醇50 mL，称定重量，超声30 min(53 kHz)后，水浴加热回流1 h，放冷，再称定质量，用65%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2色谱条件[12-14]采用赛默飞A型C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；以乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱：0～5 min(8%A)，5～15 min(8%A→10%A)，15～30 min(10%A→27%A)，30～31 min(27%A→8%A)，31～40 min(8%A)，同时设定两个检测波长，原儿茶酸、原儿茶醛检测波长为280 nm，荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、木犀草苷检测波长为350 nm。柱温30 ℃，流速1.0 mL·min-1，精密量取5 μL注入液相色谱仪。

2.3方法学考察

2.3.1专属性实验 精密量取混合对照品溶液和供试品溶液各5 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，各色谱峰分离度均符合要求(大于1.5)。色谱图见图1。

2.3.2线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液2，5，8，10，15 μL，注入液相色谱仪，按“2.2”项下的色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，质量数(μg)为横坐标进行线性回归计算。原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、木犀草苷含量均与峰面积线性关系良好。见表1。

2.3.3精密度考察 取“2.1.1”项下的对照品溶液，按“2.2”项下色谱方法，重复进样6次，测定峰面积。原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、木犀草苷峰面积的RSD分别为0.18%，0.26%，0.31%，2.09%，1.11%，2.09%，结果表明仪器精密度良好。

2.3.4稳定性考察 取供试品溶液(批号：20140728)，分别于0，2，8，12，24 h进样，进样量5 μL，测定峰面积。原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、木犀草苷的RSD分别为2.13%，1.87%，1.67%，1.03%，2.56%，2.22%。说明供试液在24 h内均很稳定。

2.3.5重复性考察 取乌蕨样品(批号：20140728)按“2.1.2”项下方法平行配制6份供试品溶液，取“2.1.1”项下的对照品溶液，按“2.2”项下方法测定峰面积。原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、木犀草苷的平均含量分别为0.9689，0.6552，1.1995，2.4594，1.1587，0.5745 mg·g-1，RSD分别为 1.83%，1.48%，1.53%，1.36%，1.39%，2.04%。

A.混合对照品溶液 B.供试品溶液 1.原儿茶酸；2.原儿茶醛；3.荭草苷；4.牡荆素鼠李糖苷；5.牡荆素；6.木犀草苷。

表1 原儿茶酸等6种成分线性关系结果

2.3.6加样回收率实验 精密称取已测定含量的样品(批号：20140728)约1.0 g，共6份，分别置具塞锥形瓶中，精密加入原儿茶酸(15.36 mg→500 mL)、原儿茶醛(6.30 mg→500 mL)、荭草苷(13.77 mg→500 mL)、牡荆素鼠李糖苷(12.00 mg→500 mL)、牡荆素(11.68 mg→500 mL)、木犀草苷(16.53 mg→50 mL，取20.00 mL→500 mL)(浓度分别为0.030 69，0.012 60，0.026 96，0.024 00，0.022 36，0.013 13 mg·g-1)的混合对照品溶液50 mL，按“2.1.2”项下方法配制供试品溶液，按“2.2”项下方法测定峰面积。6种活性成分的加样回收率结果见表2。

2.3.7样品测定 取24批样品按“2.1.2”项下方法配制供试品溶液，取“2.1.1”项下的对照品溶液，按“2.2”项下方法测定上述6种活性成分的含量。测定结果见表3。

3 讨论

乌蕨活性成分较多，通过紫外扫描，酚酸类主要成分原儿茶酸、原儿茶醛在280 nm有最大吸收或较大吸收；而黄酮类主要活性成分荭草苷、牡荆素、牡荆素鼠李糖苷、木犀草苷在350 nm有较大或最大吸收。在280 nm能够检测出6个指标成分，但在此波长检测黄酮类主要活性成分，干扰峰较多，峰纯度较低。本实验条件下其他干扰峰吸收减小或无吸收，能够排除干扰，达到峰纯度检测要求，因此同时设定两个检测波长测定6个活性成分，方法简单，结果准确。

尝试选择乙腈-水、甲醇-0.1%醋酸及乙腈-0.4%磷酸3种流动相进行HPLC梯度洗脱，结果显示，乙腈-水、甲醇-0.1%醋酸作流动相，所得部分色谱峰的峰形拖尾，分离度较差；乙腈-0.4%磷酸作流动相，各成分分离度符合要求，所得峰形较好，故选择乙腈-0.4%磷酸作为乌蕨HPLC分析测定的流动相。

通过测定多批次不同季节、不同地区的乌蕨中6种活性成分的含量，可为筛选黄酮含量高的优良种源提供参考，也可为今后人工栽培选取优良品种。

本方法简单，结果准确，重复性、稳定性较好，有助于乌蕨质量控制水平的提高。

表2 原儿茶酸等6种成分回收率实验结果

表3 乌蕨样品测定结果