虾青素通过抗氧化作用改善血管性痴呆小鼠学习记忆能力

刘翀，朱宁伟，蒋晓梅

(1.浙江省丽水市中心医院药学部，丽水 323000；2.浙江省医药高等专科学校药学系，宁波 315100)

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是老年期痴呆的常见类型之一，是由于脑组织长期处于各种缺血缺氧性损伤导致的获得性智能障碍综合征[1]。随着全球人口的老龄化，血管性痴呆患病率呈指数上升，给个人、家庭和社会都带来负担。因此，寻找治疗和预防血管性痴呆药物具有重要医学价值和社会意义。虾青素是目前抗氧化能力较强的天然药物，且能通过血脑屏障，其强大的抗氧化能力对神经系统具有保护作用[2]。目前虾青素在缺血-再灌注等缺血模型中作用有大量的研究，而在血管性痴呆模型研究较少，本实验通过永久性结扎右侧颈总动脉建立小鼠血管性痴呆模型，研究虾青素对血管性痴呆模型小鼠的学习记忆能力的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 2～3个月龄健康雄性ICR清洁级小鼠60只，体质量(30±5)g，由浙江实验动物中心提供，合格证号：SCXK(浙)2014-0001。实验期间所有动物昼夜室温控制在约22 ℃，明暗各12 h交替，均予标准饲料喂养。

1.2药品与试剂 虾青素(宁波博奥科学仪器有限公司，批号：20180326，含量≥98%)，超氧化物歧化酶 (SOD)和丙二醛(MDA)检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所(批号分别为：S0103，S0131)，ROS荧光探针-DHE购自碧云天生物技术研究所(ROS荧光探针批号：S0063)。

1.3仪器与设备 Morris水迷宫系统(中国成都泰盟科技有限公司，型号：WMT-100S)，石蜡切片机(Leica公司，型号：RM2235型)，CO2培养箱(中国力康发展有限公司，型号：HF160W型)，共聚焦激光扫描显微镜(德国Leica公司，型号：SP5型)，酶标仪(美国Thermo Fisher，型号：Multiskan)。

1.4血管性痴呆动物模型的建立及实验分组 采用永久性结扎右侧颈总动脉法制作模型。用4%水合氯醛[1 mL·(10 g)-1]腹腔注射麻醉小鼠，从小鼠颈部正中切口，沿胸锁乳突肌内侧缘分离出肌肉及筋膜，统一将右侧颈总动脉与迷走神经轻轻剥离后进行两端结扎，结扎结束后剪断颈总动脉，左侧颈总动脉不做处理，缝合切口，术后于伤口处撒少量青霉素粉末(每瓶80万U)。假手术组除不结扎及切断右侧颈总动脉外，其余操作与手术组相同。将手术组存活小鼠采用随机数字表法分成模型对照组、虾青素(50，100和200 mg·kg-1)4个组，每组11只。手术过程中5只死亡，死亡率为8%。另设假手术组11只。

1.5虾青素溶液的配制及给药方法配制 3组剂量虾青素标准液：称量虾青素于15 mL离心管中，加入为0.5%羧甲基纤维素钠溶解，最终配制成虾青素标准液。超声混悬20 min，现配现用。灌胃给药：小鼠手术休息5 d后开始灌胃给药。根据小鼠体质量分别给予50，100，200 mg·kg-1虾青素，假手术组和模型对照组给予羧甲基纤维素钠溶液，所有小鼠均按0.1 mL·kg-1每天灌胃1次，持续给药1个月。

1.6Morris水迷宫行为学 观察所有小鼠灌胃给药1个月后，进行Morris水迷宫定位航行实验，实验过程中实验室保持光线昏暗及周围环境安静状态。将水池平分为4个象限，将平台放置在1个象限的固定地方，令水面高出平台2 cm，水温保持在(24±2) ℃。将各组小鼠从同一象限放入水中，录像记录大鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)，若大鼠在60 s内找不到平台，实将其放上平台并保持10 s，将其从平台上取下休息20 s后，依次进入下一象限实验。若小鼠在60 s内找到平台，令其在平台上休息10 s后取下，其余操作同前，持续5 d重复实验。通过实验视频分析软件导出数据，分析平均速度和平均逃避潜伏期。

1.7强迫游泳实验 所有小鼠灌胃干预1个月后，进行强迫游泳实验。第1天将小鼠置于游泳桶中游泳 15 min进行，游泳桶尺寸为15 cm×25 cm，取出后烘干，归笼。第2天，在同样的条件下进行强迫游泳6 min，记录后4 min在水中静止不动时间。静止不动的标准为小鼠只将头部露出水面漂浮于水面，除了避免没入水中而向上的主动运动外，无其他行为，不动时间越长，表明动物越绝望。

1.8Nissl染色 水迷宫实验和强迫游泳实验结束处死小鼠，取部分脑组织置于4%多聚甲醛固定后，石蜡包埋、切片后制作成切片厚度5 μm，按Nissl染色试剂盒标准步骤进行实验，剩余脑组织-20 ℃保存备用用于后续实验检测。

1.9SOD和MDA检测 取各组小鼠海马组织，按每10 mg加入SOD样品制备液100 μL，比例在4 ℃或冰浴进行匀浆。随后在4 ℃离心机12 000×g离心3～5 min，取上清液作为待测样品。按照BAC试剂盒步骤测定样本蛋白浓度。然后根据SOD和MDA检测按照试剂盒说明书步骤测定样品中SOD活力和MDA含量。

1.10活组织ROS荧光探针-DHE染色 小鼠麻醉后迅速处死取脑，沿海马槽走向连续冠状面切片，切片厚度400 μm。将脑片放入持续通入混合氧气的人工脑脊液中静置15 min后，随后按照试剂盒说明书进行染色，染料浓度5 nmol·L-1，CO2培养箱中孵育30 min，孵育结束后立即置于共聚焦激光扫描显微镜下观察。

2 结果

2.1平均速度 各组小鼠平均运动速度均随着训练天数增加而降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，各组内每日平均运动速度差异无统计学意义(P>0.05)(图1)，说明小鼠运动能力无差异，排除因小鼠的运动能力影响寻找平台时间。

2.2平均逃避潜伏期 各组小鼠5 d的逃避潜伏期时间见图2，假手术组平均逃避潜伏期时间随着实验时间的增加而缩短。模型对照组平均逃避潜伏期在第3天有所下降，5 d的平均逃避潜伏期时间均高于假手术组。虾青素组小鼠平均逃避潜伏期时间均随着训练天数增加而缩短，虾青素组200 mg·kg-1在第4和第5天的平均逃避潜伏期时间较模型对照组显著下降(P<0.05)与假手术组走势相似；虾青素50，100 mg·kg-1两组小鼠平均逃避潜伏期与模型对照组相比差异无统计学意义。

图1 5组小鼠平均运动速度

2.3强迫游泳时间强迫游泳实验结果 如图3所示，与假手术组相比，模型对照组(P<0.01)、虾青素组50 mg·kg-1(P<0.05)及100 mg·kg-1(P<0.05)在水中静止不动的时间显著延长。相比于模型对照组，应用虾青素组小鼠的水中静止时间均有所下降，其中应用虾青素组200 mg·kg-1水中静止不动的时间与模型对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

①与模型对照组比较，P<0.05。

①与模型对照组比较，P<0.01；②与假手术组比较，P<0.05；③与假手术组比较，P<0.01。

2.4Nissl染色Nissl染色结果 见图4，模型对照组小鼠神经元结构出现明显破坏，尤其在CA1和CA3区，神经元固缩且深染，细胞周围间隙增大呈空泡样变。假手术组小鼠细胞排列层次分明，细胞结构完整，尼氏体呈深蓝色。虾青素3个剂量组小鼠海马结构细胞排列整齐且层次分明，细胞结构完整，尼氏体呈深蓝色，空泡样变消失，尤其在CA1和CA3区神经元改善较为明显。

2.5检测海马中SOD和MDA含量 模型对照组小鼠海马组织中 SOD 活力值比假手术组显著下降(P<0.05)，而MDA含量显著升高(P<0.05)。相比于模型对照组，虾青素3个剂量组均能提高SOD活力值，降低MDA含量，且呈剂量依赖性。虾青素组200 mg·kg-1SOD活力值较模型对照组显著升高(P<0.05)，而MDA值显著降低(P<0.05)。虾青素组100及50 mg·kg-1的SOD值及MDA值与模型对照组比较，差异无统计学意义(图5)。

2.6检测小鼠海马三亚区ROS荧光 各组小鼠海马结构CA1、CA3和DG区ROS荧光强度存在组间差异，假手术组3个亚区ROS荧光强度均低于模型对照组，且CA1区和CA3区的差异最明显，差异有统计学意义(P<0.001)，说明单侧颈总动脉结扎手术引起海马3个亚区中ROS高；虾青素3个剂量组灌胃后，虾青素组200 mg·kg-1小鼠海马结构CA1、CA3和DG区中ROS荧光强度均暗于其他两个剂量组，与模型对照组比较，差异具有统计学意义(在CA1区P<0.01，在CA3和DG区均P<0.05)；而虾青素组50 mg·kg-1和虾青素组100 mg·kg-1海马结构中3个亚区的ROS荧光强度较模型对照组均有所下降相似，但与模型对照组比较，差异无统计学意义(图6)。

3 讨论

参考国内外研究并无虾青素给药的剂量，大部分选择25 mg·kg-1到100 mg·kg-1进行实验[3]，因此本次实验分别设置50，100，200 mg·kg-1(小、中、大)3个剂量组来探讨虾青素对VD小鼠的影响。

VD是指大脑中对记忆、认知和行为至关重要区域损伤引起的认知功能丧失，在一定程度上会影响日常生活[4]，目前并没有有效的防治方法。已有研究报道虾青素对缺血引起的神经损伤具有保护作用。同时虾青素还能通过哺乳动物的血脑屏障[5]，作用于中枢神经系统，是一种潜在治疗VD的药物。本次实验通过灌胃给予不同剂量虾青素，考察药物对于VD的防治作用。

图4 5组小鼠海马结构CA1、CA3和DG区尼氏染色(Bar：100 mm)

①与模型对照组比较，P<0.05。

本实验采用永久性结扎单侧颈总动脉建立VD模型，实验中统一结扎右侧颈总动脉(RUCCAO)，保留左侧，小鼠的死亡率约为8%。术后Morris水迷宫实验及强迫游泳实验结果证实，模型对照组的平均逃避潜伏期时间及在水中的静止时间均显著高于假手术组(均P<0.05)，且平均逃避潜伏期时间在第3天后两组时间差距变大，这表明两组小鼠在学习记忆能力上具有显著差异。Nissl染色结果表明模型对照组小鼠海马神经元损伤严重，尤其在CA1和CA3区。上述行为学结果和形态学结果都证实采用永久性结扎单侧颈总动脉能导致小鼠的学习记忆能力下降，并损害神经元，可用于的血管性痴呆小鼠模型建立。

药物干预实验结果证实，虾青素3个剂量组平均逃避潜伏期时间及水中的静止时间均低于模型对照组，其中虾青素组200 mg·kg-1是3个剂量组中改善最明显的与模型对照组相比差异有统计学意义，同时，Nissl染色结果表明，给予AST后VD小鼠海马CA1区和CA3区神经元损伤较模型对照组明显减轻，说明灌胃给药虾青素能够减少VD小鼠海马神经元损伤从而改善其学习记忆能力，且作用呈剂量依赖性。

①与模型对照组比较，P<0.01；②与模型对照组比较，P<0.05。

同时本次实验还对虾青素治疗VD的机制进行了考察。蒋青等[6]认为氧化应激在血管性痴呆发生发展中扮演重要角色。正常情况下氧自由基会被机体自身的抗氧化物质如 SOD 清除，维持氧化系统和抗氧化系统动态平衡；而长期处于低氧低灌注的条件下，抗氧化物质的大量消耗导致羟自由基(·OH)等ROS积累，从而造成氧化应激损伤，是引起VD的重要机制。聚集在体内的ROS氧化生物膜诱发脂质过氧化反应，引起MDA和GSH含量以及SOD活性异常，最终损伤神经元[7]。因此体内ROS、SOD及 MDA含量能直接反映了氧化应激损伤的严重程度。本研究证实，血管性痴呆小鼠海马结构中ROS含量和MDA含量较假手术组明显升高，而SOD 活力值显著下降，说明血管性痴呆小鼠脑内存在着明显的氧化应激损伤。而虾青素3个剂量组小鼠海马结构中ROS荧光强度和MDA含量均低于模型对照组，SOD活力值高于模型对照组，且虾青素组200 mg·kg-1效果最为明显。说明虾青素能够通过抗氧化应激损伤机制对VD引起的认知功能障碍发挥神经保护作用。其原因可能是虾青素具有较强的抗氧化性，能够通过其抗氧化作用在多种疾病模型中发挥治疗作用[8]。如虾青素可以通过改变MDA、 GSH含量以及SOD活性来改善蛛网膜下腔出血，减轻早期脑损伤等[9]。

另外，本次实验还发现Nissl染色中，模型对照组海马三区神经元损伤以CA1区和CA3区最为严重，在DHE染色结果中，模型对照组海马三区ROS水平以CA1和CA3区显著高于假手术组。这一结果表明，在缺血状态下海马三区CA1和CA3区极容易受损。虾青素干预后，海马CA1区和CA3区神经元改善明显，且两亚区ROS水平降低异常显著。尽管3个给药组改善海马神经元损伤效果相似，但分子生物学存在差异。这潜在的机制为后续研究提供了思路。

综上所述，虾青素能通过清除活性氧自由基、恢复抗氧化酶的活性等抗氧化作用来改善血管性痴呆小鼠模型认知功能，发挥神经元保护作用，且作用具有剂量依赖性，为虾青素预防和治疗血管性痴呆提供实验依据。