长春西汀在大鼠尿液中的代谢物研究

唐蕾，艾超

(清华大学附属北京清华长庚医院药学部，清华大学临床医学院，北京 102218)

长春西汀(vinpocetine)是从夹竹桃科小蔓长春花中提取出的一种吲哚类生物碱，化学名为乙基阿朴长春胺-22-乙酸乙酯，系脑血管扩张剂，能维持或恢复脑血管的生理性扩张，增加缺血区的正常脑血流量，改善缺氧脑组织的代谢[1-2]。长春西汀脂溶性较强，进入体内之后可以迅速转化成其活性代谢物阿朴长春胺酸[3-4]而发挥药效，临床应用广泛而重要。

目前有薄层色谱法(thin layer chromatography,TLC)、质谱法(mass spectrum,MS)、放射色谱法、红外光谱法(infrared absorption spectrum,IR)测定生物样品中长春西汀或阿扑长春胺酸单一成分。但所采用的放射色谱法、红外光谱法等分析方法灵敏度低、样品制备繁琐并且对人体辐射危害较大。因此笔者在本实验拟采用快速、灵敏、专属的液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术对长春西汀在大鼠体内的代谢进行研究，推测其在体内可能的代谢途径，为长春西汀的体内代谢研究提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1仪器 Waters Quattro Micro API型三重四极杆串联质谱仪，配备电喷雾离子化源(ESI源)及Masslynx 4.1 系统软件，美国Waters公司；ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；L-128B型试管氮吹浓缩仪(北京来亨科贸有限公司)；L-119 型试管恒温加热仪(上海来亨科贸有限公司)；TGL-16G台式离心机(上海安亭仪器厂)；AL-104型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，感量：0.1 mg]。

1.2试药 长春西汀对照品(含量：99.4%，批号：100947-201203，中国食品药品检定研究院)；阿朴长春胺酸对照品(含量：99.8%，批号：1166-002A3，加拿大TLCPharmaChem Inc公司)；长春西汀片剂(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，规格：每片5 mg)；甲醇为色谱纯，购自TEDIA，纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

1.3动物 健康雄性SD大鼠6只，体质量230～240 g，沈阳药科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2010-0001号。饲养条件：温度(22±2) ℃，相对湿度(50±10)%，12 h交替照明，自由进食进水。

1.4样品的收集与处理

1.4.1给药方案与样品的收集 给药方案：健康SD大鼠给药前禁食12 h，自由饮水。以相当于长春西汀4 mg·kg-1的剂量灌胃给药，给药后继续禁食4 h(长春西汀成人用法用量，30 mg·d-1。换算SD大鼠计量4 mg·kg-1)，大鼠尿液样品的收集：每只大鼠单独置于代谢笼内饲养，12 h 昼夜更替。实验前收集空白尿液，灌胃给药后，于冰浴条件下收集0～24 h尿液样品，置-80 ℃冷冻保存，待测。

1.4.2样品预处理 采用固相萃取的方法进行预处理，用甲醇、水各3.0 mL 交替活化固相萃取小柱各两次。取3500 r·min-1，离心半径r=6.5 cm，离心10 min后的尿液样品1 mL，微孔滤膜过滤，以1.5 mL·min-1速度通过上述已经活化好的固相萃取柱，依次用水1 mL，甲醇(1 mL×2)洗脱，收集甲醇部分的洗脱液，于40 ℃氮气下吹干，残渣用甲醇-水(10：90，V/V)混合溶液100 μL 溶解，20 μL进样分析。

1.5LC-MS/MS分析条件

1.5.1色谱条件 色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司)；流动相为甲醇-水梯度洗脱：甲醇在15 min内从10%线性变化至95%，维持3 min，之后恢复到初始条件，平衡3 min；流速：0.2 mL·min-1；进样量为20 μL；柱温为30 ℃。

1.5.2质谱条件 离子源为电喷雾离子化源(ESI源)；毛细管电压为2.0 kV；锥孔电压为40 V(长春西汀、阿朴长春胺酸)和20 V(内标非那西汀)；去溶剂气为氮气(N2)；去溶剂气温度为400 ℃；源温度为110 ℃；去溶剂气流速为450 L·h-1，采用正离子方式检测；采用一级全扫描、选择离子监测和产物离子扫描方式同时进行测定。

2 结果

2.1长春西汀的质谱裂解规律 见图1，2。由图1可知，长春西汀原型M0(m/z351)含有酯键不稳定，容易断裂生成阿朴长春胺酸(M1m/z323)；M0和M1易脱掉含氮的三元环、四元环和五元环生成m/z308、m/z280、m/z266的碎片离子。

图1 M0的二级质谱图及其化学结构式

2.2大鼠尿液中的代谢研究 大鼠空白尿液样品和灌胃给予长春西汀后尿液样品的SIR色谱图见图3所示。同空白尿样相比，给药后的大鼠尿样中共检测到4种代谢物。通过与对照品的色谱、质谱行为比较，鉴定了1个代谢物的结构，为阿朴长春胺酸(M1)。通过综合分析色谱保留行为、准分子离子和二级碎片离子，并根据药物代谢规律，推断了3个代谢物的结构 (M2a/M2b、M3、M4)。

代谢物M1。色谱保留时间为5.6 min。准分子离子峰[M+H]+为m/z323，通过与阿朴长春胺酸的对照品比对，鉴定出M1为阿朴长春胺酸，M1的质谱图和裂解规律见图4，5。

图2 推测的M0质谱裂解规律

图3 大鼠尿液中长春西汀代谢物的典型SIR色谱图A.空白尿液；B.含药尿液

图4 M1的色谱图及其准分子离子峰的二级质谱图A.对照品；B.含药尿液样品；C.二级质谱图

图5 推测的M1质谱裂解规律

代谢物M2。色谱保留时间为12.4和13.3 min，准分子离子峰[M+H]+为m/z367，比原型药物多16 Da，提示可能为长春西汀的一羟基化代谢物。在LC-MS/MS分析中，产生碎片离子m/z323、m/z294和m/z280。其中，m/z323为与原型一致的酯键水解生成的碎片离子，m/z294和m/z280推测为分别脱掉含氮的四元环和含氮的五元环生成的碎片离子(图6)。由文献[5]可知羟化位点存在于苯环上，但具体的羟化位点不确定，推测M2a和M2b为苯环上羟化部位不同的两个同分异构体。M2的质谱裂解规律见图7。

图6 M2的二级质谱图及其化学结构式

图7 推测的M2质谱裂解规律

代谢物M3。色谱保留时间为10.6 min，准分子离子峰[M+H]+为m/z369，比原型药物的准分子离子多18 Da，提示其可能为长春西汀一水加成物。在LC-MS/MS分析中，产生的碎片离子m/z351推测为脱掉水生成的碎片，并且m/z351进一步生成的碎片离子m/z323、m/z294、m/z280和m/z308与M0的碎片一致，根据文献[5]推测M3为M0的一水加成物。见图8。

代谢物M4。色谱保留时间为11.5 min，准分子离子峰[M+H]+为m/z383，与原型药相比多32 Da，提示其可能为长春西汀二羟基化代谢物。在LC-MS/MS分析中，产生碎片离子m/z367、m/z337和m/z305，其中m/z367的碎片离子比m/z383的碎片离子少16 Da，提示为后者脱掉一个羟基上的氧生成的碎片离子，m/z337的碎片离子推测为在m/z367的基础上脱掉侧链上的乙基再生成双键产生的碎片离子，m/z305的碎片离子比m/z337的碎片离子少32 Da，提示由后者进一步脱掉2个氧生成的碎片离子。见图9。因此，推测代谢物M4为长春西汀的二羟基化代谢物，但是具体的羟化位点不确定。M4的质谱裂解规律见图10。

图8 M3的二级质谱图及其化学结构式

图9 M4的二级质谱图及其化学结构式

图10 推测的M4质谱裂解规律

2.3长春西汀在大鼠尿液中代谢的总结 根据检测到的上述代谢物，可以推断长春西汀在大鼠尿液中有4种代谢途径，分别为酯键水解，一水加成，一羟基化和二羟基化，均属于Ⅰ相代谢。

3 讨论

关于长春西汀的体内代谢研究，VERECZKEY[5]采用薄层色谱法(TLC)和质谱法(MS)结合的方法研究了长春西汀在比格犬体内的代谢，共检测出3种代谢物：阿朴长春胺酸、一羟基化长春西汀和二羟基化阿朴长春胺酸甘氨酸结合物；VERECZKEY等[6]采用放射色谱法、MS和红外光谱法(IR)结合的方法研究了长春西汀在大鼠体内的代谢，检测到的代谢物与文献[5]一致。YANG等[7]总结了长春西汀及其结构类似物在大鼠、兔、犬及人体内的代谢物，除了以上3种外，还有一羟基化阿朴长春胺酸、长春西汀一水合物、二羟基化阿朴长春胺酸甘氨酸结合物及与葡萄糖醛酸或硫酸的结合物。本实验对长春西汀在大鼠体内的代谢情况进行了初步研究，对大鼠尿液中长春西汀代谢物的结果分析，通过与代谢物对照品的色谱、质谱行为比较，鉴定了1个代谢物的结构(M1)，通过综合分析色谱保留行为、准分子离子和二级碎片离子，推断了3个代谢物的结构 (M2、M3、M4)，分别是M1-阿朴长春胺酸、M2-长春西汀一羟基化合物、M3-长春西汀一水加成物和M4-长春西汀二羟基化合物，M4笔者目前尚未见文献报道，为长春西汀的体内代谢研究提供借鉴和参考。