长春西汀注射液中的基因毒性杂质研究与含量测定

陈雪江 郭丽蓉 沈红娅 刘 勇 杨 志

长春西汀注射液是由主药长春西汀和辅料山梨醇、苯甲醇、维生素C、焦亚硫酸钠、酒石酸加水制成的无菌注射液，临床主要用于改善脑梗死后遗症、脑出血后遗症、脑动脉硬化症等诱发的各种症状[1-4]。基因毒性杂质是指能够直接或间接损伤细胞DNA，产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能或倾向的化合物。根据国际人用药物注册技术要求协调会（ICH）和欧洲药品质量管理局（EMA）的调查研究表明，醛类化合物均被列为潜在的基因毒性杂质[5-6]。而根据本实验研究表明，长春西汀注射液中含有微量的苯甲醛和糠醛，分别来自其辅料维生素C的降解和辅料苯甲醇的氧化后生成，该药物中苯甲醛和糠醛含量的多少对临床用药的安全性起着至关重要的作用。

1 仪器与试药

1.1 仪器Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），Agilent 1260二极管阵列检测器，Waters XSELECT CSH C18色谱柱（4.6×250 mm，5 μm），LC Open lab色谱数据工作站。

1.2 试药长春西汀注射液（自制，批号：ZEA1601、ZEA1602、ZEA1603）；长春西汀注射液（河南润弘制药股份有限公司生产，批号：1206211）；长春西汀注射液（原研厂家进口产品，匈牙利吉瑞大药厂生产，批号：A46071A、A44024A、A3B023A）。苯甲醛对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号：111650-201303）；糠醛对照品（西格玛试剂公司提供，批号：SHBF0159V）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[7-10]以0.2 mol/L乙酸铵溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，洗脱梯度见表1。检测波长 280 nm；进样 10 μl；柱温 25 ℃；流速 1.0 ml/min。

表1 流动相梯度洗脱表

2.2 长春西汀注射液中苯甲醛、糠醛的定位与分析取苯甲醛对照品、糠醛对照品适量，加流动相稀释至约10 μg/ml的溶液；另取长春西汀注射液2.0 ml，置10 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度。进样10 μl，记录色谱图。通过与对照品保留时间的比对，结果表明长春西汀注射液中含有基因毒性杂质糠醛和苯甲醛，保留时间分别为4.21 min和7.79 min。见图1。

图1 长春西汀注射液中的苯甲醛和糠醛定位分析

2.3 长春西汀注射液中苯甲醛、糠醛的来源分析由于长春西汀注射液处方中含有辅料苯甲醇和维生素C，苯甲醇在生产或贮藏过程中会缓慢氧化而生成少量的杂质苯甲醛，而维生素 C在水溶液状态下也会缓慢降解生成杂质糠醛，故长春西汀注射液中的基因毒性杂质苯甲醛和糠醛主要来源于辅料苯甲醇和维生素C的氧化、降解产生（图2）。

图2 苯甲醛、糠醛的来源分析

2.4 长春西汀注射液中苯甲醛、糠醛的校正因子测定长春西汀注射液的质量标准[10]中未将苯甲醛、糠醛列为特定杂质进行控制，该质量标准中有关物质检查仅列出了由原料药引入的 4个已知杂质，其余未知杂质均通过主成分自身对照法进行粗略的限度控制。

精密称取长春西汀对照品适量，加流动相溶解并定量稀释制成 10 μg/ml、2 μg/ml、0.4 μg/ml三个浓度梯度的标准溶液。另精密称取苯甲醛对照品和糠醛对照品，同法稀释制备 10 μg/ml、2 μg/ml、0.4 μg/ml三个浓度梯度的标准溶液。取上述标准溶液各进样10 μl，记录色谱图，计算苯甲醛、糠醛与长春西汀的相对校正因子，结果见表2。

表2 苯甲醛、糠醛校正因子测定结果

在同一色谱条件下，苯甲醛、糠醛与长春西汀的相对校正因子均超出 0.9～1.1的范围内，采用峰面积归一化法或主成分自身对照法计算其含量时，会由于色谱响应值的差异产生较大误差，故长春西汀注射液中的苯甲醛和糠醛含量测定不宜采用质量标准中规定的主成分自身对照法，而应采用外标法或乘以校正因子进行其含量计算。

2.5 长春西汀注射液中苯甲醛、糠醛的含量测定取苯甲醛对照品、糠醛对照品适量，加流动相稀释至约1.0 μg/ml的溶液，作为对照品溶液；另取长春西汀注射液2.0 ml，置10 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为供试品溶液。进样10 μl，按外标法计算不同厂家生产的长春西汀注射液中苯甲醛和糠醛的含量，结果见表3。

表3 苯甲醛、糠醛的含量测定结果

结果显示，不同厂家生产的长春西汀注射液中均检出含有毒性杂质苯甲醛和糠醛，其含量略有差异，苯甲醛含量在0.03%～0.07%之间，糠醛含量在0.006%～0.05%之间。

2.6 长春西汀注射液中苯甲醛、糠醛的限度及安全性评价目前，药品中的基因毒性杂质一般采用每日允许最大暴露量（PDE）和毒性物质限量（TTC）来进行杂质的限量控制。查阅 CPDB（The Carcinogenic Potency Database）数据库，苯甲醛和糠醛的半数中毒剂量（TD50）结果详见表4。

表4 苯甲醛、糠醛毒性数据

根据苯甲醛和糠醛的TD50数据，采用线性外推法，计算出苯甲醛和糠醛的毒性物质限量（TTC）分别为1490 μg/d和197 μg/d；根据长春西汀注射液中苯甲醛和糠醛的含量测定结果，推算出本品中苯甲醛和糠醛含量均处于安全限度范围内，结果见表5。

根据TTC推算出长春西汀注射液中苯甲醛和糠醛的理论杂质限度为4.97%和0.66%，结合本品中糠醛、苯甲醛实际测定结果，不同厂家生产的长春西汀注射液中苯甲醛和糠醛的含量远低于二者的理论杂质限度，故可认为长春西汀注射液中苯甲醛和糠醛含量处于安全限度范围内。

表5 苯甲醛、糠醛安全性分析

2.7 长春西汀注射液中苯甲醛、糠醛的稳定性考察酸破坏：精密量取长春西汀注射液2.0 ml，加1 mol/L盐酸溶液2 ml，室温放置24 h后取样测定杂质变化情况。碱破坏：精密量取长春西汀注射液2.0 ml，加1 mol/L氢氧化钠溶液1 ml，室温放置4 h后取样测定杂质变化情况。高温破坏：精密量取长春西汀注射液2.0 ml，于100 ℃的恒温干燥箱中放置24 h后取样测定杂质变化情况。氧化破坏：精密量取长春西汀注射液2.0 ml，加入5%双氧水溶液4 ml，室温放置4 h后取样测定杂质变化情况。

结果显示，长春西汀注射液经酸、碱、氧化、高温破坏后，其杂质种类和数量均有不同程度的增加。经酸、碱破坏后，长春西汀注射液中的苯甲醛和糠醛含量无显著变化；经高温破坏24 h后，长春西汀注射液中的苯甲醛峰面积由2.5增加到16.5，其含量增加了6倍；糠醛峰面积由5.3增加到27.5，其含量增加了5倍。经5%双氧水破坏4 h后，长春西汀注射液中的苯甲醛峰面积由2.5增加到56.2，其含量增加了22倍。结果表明，长春西汀注射液中的苯甲醛和糠醛含量不稳定，在高温和氧化剂存在的条件下，苯甲醛和糠醛含量会显著增加。

3 讨论

不同厂家生产的长春西汀注射液中均含有微量的苯甲醛和糠醛，分别来自其辅料维生素C的降解和辅料苯甲醇的氧化后生成，苯甲醛含量在0.03%～0.07%之间，糠醛含量在0.006%～0.05%之间，含量均处于安全限度范围之内。

经长春西汀注射液稳定性考察结果表明，长春西汀注射液对酸、碱、氧和高温均较为敏感，在100 ℃条件下放置24 h后，糠醛含量增加了5倍，苯甲醛含量也增加了 6倍；在有氧氧化剂存在的条件下，样品放置24 h，其苯甲醛含量增加了22倍。因此，要求长春西汀注射液在贮藏过程中应避免高温、阳光直射，在临床使用过程中应尽量避免药物与空气的长时间接触。

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[10]中华人民共和国国家药典委员会.关于长春西汀注射液国家标准的公示. [EB/OL].[2012-03-15].http://www.chp.org.cn