体外三维培养技术在肿瘤中的应用及进展

孙跃峰,江 剑,王 玲,王 宏

(1．大连医科大学附属第一医院 脊柱外科,辽宁 大连 116011；2.南方医科大学附属第三医院 微创脊柱外科,广东 广州 510000；3.大连医科大学附属第一医院 肿瘤科,辽宁 大连 116011)

肿瘤的发病率和死亡率在全世界范围内正逐年增加，成为威胁公众健康的主要原因之一。一项调查显示，从2002年到2012年，全球肿瘤发病人数及死亡人数分别增加到1400万和827万左右[1]。2015年，中国大约有430万肿瘤新诊断病例以及280万人死于恶性肿瘤，相当于平均每天有1.2万人被诊断患有肿瘤以及7.5万人死于恶性肿瘤[2]。因此，更加全面地理解肿瘤的发生、增殖以及转移的潜在分子机制成为治疗肿瘤的关键。近年来有证据表明，肿瘤微环境(tumor environment，TME)在肿瘤增殖和进展中具有不可替代的作用[3]。肿瘤微环境由细胞成分及非细胞成分组成。其中细胞成分包括内皮细胞(endothelial cells，EC)、肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts，CAFs)、转化上皮细胞(transformed epithelial cells，TEC)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)等，它们与肿瘤细胞相互作用，影响肿瘤的生长、转移以及耐药性等生物学特性[4-12]。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、生长因子、趋化因子和细胞因子等非细胞成分在促进恶性肿瘤细胞的生长和存活、诱导其他细胞向细胞外基质迁移等方面发挥着重要作用[13-14]。与传统的二维细胞培养技术(two-dimensional cell culture，2DCC)不同，三维细胞培养(three-dimensional cell culture,3DCC)能够模拟真实的细胞异质性以及细胞微环境，并且提供了细胞—细胞、细胞—细胞外基质(extracellular matrix，ECM)相互作用的信息，为细胞间信号传导及分子靶点的药物开发和验证提供了新方法[15-19]。

1 无支架的3DCC

无支架的3DCC是由多种不同类型的细胞自发聚集而产生的细胞球状体。该技术适用于培养分泌ECM蛋白并能自组装成三维组织样结构的肿瘤细胞，如炎性乳腺癌细胞。与基于支架的3DCC相比，无支架的多细胞肿瘤球体由排列松散的细胞组成，纤维连接蛋白均匀分布于整个球体内[20-21]。

1.1 液体覆盖法

1.1.1 琼脂糖包被培养板

Charoen等[26]利用琼脂糖包被的96孔板分别培养骨肉瘤细胞和乳腺癌细胞，随后将多细胞肿瘤球体嵌入胶原凝胶中，并对整个球状体和单个细胞进行定量和定性分析。作者认为，该模型结合了肿瘤细胞球状体结构和细胞外基质的优点，在以往三维球状体模型成功的基础上，扩展了将单个大小可控的球状体作为肿瘤模型嵌入胶原凝胶的制备方法。此方法将促进对肿瘤细胞行为的研究，提高对新型抗肿瘤药物的评价，加快具有数据建模和预测功能的仿真软件的开发。Geiger等[27]为了检测galectin-1对乳腺癌细胞增殖、凋亡潜能、代谢活性以及它们对TF(Thomsen-Friedenreich)肿瘤抗原表达依赖性的影响，用同样的培养方法对MCF-7和T-47D两种乳腺癌细胞系进行了体外三维培养。他们发现，在单层细胞以及球状体细胞培养模型中，galectin-1能够抑制高表达TF抗原的乳腺癌细胞的增殖和代谢活性，诱导细胞凋亡。

1.1.2 Poly-HEMA包被培养板

Kuen 等[28]为了确定诱导免疫抑制肿瘤微环境的关键细胞机制，建立了胰腺癌细胞、CAFs和单核细胞的三维共培养模型。在poly-HEMA包被的6孔板中，每孔接种2.5×105个肿瘤细胞用于单层细胞培养，每孔1×105个肿瘤细胞以及1.5×105个MRC-5成纤维细胞用于共培养。他们发现，单核细胞与胰腺癌细胞以及成纤维细胞的3D共培养可诱导产生免疫抑制细胞因子，并且这些细胞因子可促进M2型巨噬细胞和骨髓源抑制细胞(myeloid derived suppressive cells，MDSCs)的极化。这些共培养的多细胞球状体具有抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖等免疫抑制功能，而这种功能可以被精氨酸酶1(arginase-I)等免疫抑制因子阻断剂所部分逆转。Choe等[29]用同样的方法对肺腺癌细胞系A549进行体外三维培养以及传统的二维培养，目的是为了确定一种名为“SOX2”的多能调节因子在肿瘤细胞生长过程中的作用。作者认为，SOX2在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)疾病进展期间通过其下游信号传导介质AKT激酶促进锚定非依赖性生长和化学抵抗性，使得SOX2可能成为治疗NSCLC的潜在靶点。

1.1.3 超低结合培养板

Gebhard等[30]利用超低结合培养板建立了一个由犬骨肉瘤细胞构建的无支架三维细胞培养系统，并通过光镜和电镜对多细胞球状体和单层细胞进行评价和比较。他们发现，多细胞球状体显示出独特的I型胶原网络，比单层培养物更接近真实的体内环境。此外，球状体坏死中心存在大量骨钙素，而周边区域则以细胞增殖为主。说明犬骨肉瘤细胞所构建的无支架三维多细胞球状体相比单层细胞，能更好地模拟体内肿瘤结构，尤其是细胞—细胞及细胞—细胞基质间的相互作用。Pang等[31]成功地从原发性犬骨肉瘤和已建立的细胞系中分离出癌症干细胞(cancer stem cells，CSCs)，并且发现它们可以在6孔超低结合培养板中形成肿瘤球状体以及对化疗药物具有耐药性。进一步利用基因芯片技术发现分离的骨肉瘤干细胞和子代黏附细胞的基因表达谱存在显著差异，且环氧合酶-2(COX-2)在CSCs肿瘤球状体中的表达量是子代黏附细胞的141倍。COX-2抑制剂对CSCs的生长没有影响，却对子代细胞球状体的形成起到了抑制作用，这表明COX-2在肿瘤起始过程中可能发挥重要作用。

1.2 悬滴法

悬滴法是无支架培养三维多细胞肿瘤球体最广泛使用的方法之一，因悬浮细胞在液滴中由于重力原因自发聚集成细胞球状体而得名[32]。多细胞肿瘤球体的大小可根据悬浮细胞密度决定，细胞接种以后将培养板倒置，由于表面张力细胞悬液变成细胞悬滴保持在适当位置不动，细胞在液滴与空气界面处的液滴尖端积聚并增殖[33]。

Amann等[34]采用与自动化兼容的多孔悬滴微滴板，将NSCLC的两种细胞系A549和COLO-699分别与肺成纤维细胞进行三维单培养或共培养。他们发现，与共培养相比，A549在单培养中存活率较低；而COLO-699则在单培养中存活率较高。同时，在培养过程中两种细胞系的波形蛋白表达量增加，E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达量减少。 Raghavan等[35]采用一种新颖的体外三维细胞培养模型：在新型384孔悬滴阵列培养板中将10个卵巢癌细胞培养成单个球状体。他们认为，在高通量384孔板中，极少的细胞数量便可产生卵巢癌细胞球状体，且具有较高的存活率。相比于传统的二维培养，细胞球状体表现出更高的耐药性。

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2 基于支架的3DCC

参与多细胞肿瘤球体形成的生物活性支架通常包括天然材料以及合成材料，它们不仅支撑肿瘤细胞的三维组织结构，而且促进细胞—细胞、细胞—基质之间的相互作用，影响肿瘤细胞的迁移、增殖和聚集[36-37]。常见的天然支架材料有胶原、藻酸盐、壳聚糖、丝素蛋白、透明质酸、弹性蛋白、粘多糖等[38-39]。相比于合成支架，天然支架具有更好的生物兼容性，但机械强度不如合成支架[40]。常见的合成支架材料有聚羟基酸、聚羟基丁酸酯、聚羟基酮、聚羟基丁酸酯—共羟基戊酸酯等，它们具有比天然支架更高的机械强度，可用于刚性支架的构建[41]。

2.1 天然支架

2.1.1 藻酸盐

Akeda等[42]采用一种新型小鼠骨肉瘤三维藻酸盐球形培养系统，将两种具有高肺转移潜力的细胞系Dunn及LM8包埋在藻酸盐珠中，探究人类骨肉瘤发生发展和转移的机制。他们发现，LM8细胞系中分离细胞的数量高于Dunn细胞系。在体内藻酸盐珠转移模型中，LM8细胞比Dunn细胞有更高的肺转移率。该培养系统中的细胞特征和动力学反映了其在体内的恶性潜能。

2.1.2 基质胶及胶原

Elenjord等[43]利用三维纤丝原纤维和二维单聚体胶原体外细胞培养模型，探究细胞胶原I相互作用对基质金属蛋白酶-2(MMP-2)合成和活化，以及膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)和金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)合成的影响。他们发现，MMP-2的合成和活化受骨肉瘤细胞与I型胶原相互作用的影响。 Gorska等[44]在基质胶中培养高转移性骨肉瘤细胞系来探究有限氧渗透对氮氧化应激标志物表达的影响。他们在检测了细胞活力、氮氧化应激标志物及血管内皮生长因子基因表达后认为，商业细胞株对低氧高度敏感，低氧条件可诱导细胞环境氧化，因此可能无法构成良好的骨组织工程三维培养模型。Kim等[45]同样利用基质胶对膀胱癌细胞的两种细胞系SBT31A 和T24进行体外三维培养。他们研究了细胞周期蛋白D1b(cyclin D1b)小干扰RNA(siRNA)对表达cyclin D1b 信使RNA(mRNA)的人膀胱癌细胞系SBT31A和T24的抑癌作用，发现抑制cyclin D1b的表达可以通过诱导细胞凋亡、抑制癌细胞干性及上皮-间质转化，从而抑制膀胱癌细胞的恶性表型。Alshareeda等[46]利用基质胶将绒毛膜来源的间充质干细胞(chorionic villi derived mesenchymal stem cells，CVMSCs)与三阴乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)细胞系MDA-MB-231共培养，建立了体外三维共培养模型。他们观察到，在MDA-MB-231与CVMSCs共培养体系中加入人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，不仅抑制了HUVECs的血管生成能力和MDA-MB-231细胞的增殖迁移能力，而且降低了MDA-MB-231特征性细胞因子的表达。

2.1.3 丝素蛋白

Talukda等[47]利用丝素蛋白支架实现了人乳腺癌细胞与人成骨样细胞及间充质干细胞的三维共培养。这种支架材料在结构上比其他天然生物材料更耐蛋白酶降解。他们发现，乳腺癌细胞与成骨样细胞通过分泌产物相互作用，成骨样细胞数量减少，细胞外基质矿化，并且共培养细胞在耐药性、侵袭性和血管生成性方面有显著提高。

2.1.4 透明质酸

透明质酸同样也可以作为构建体外三维培养模型的支架材料。Xu等[48]开发了一种透明质酸双分子层水凝胶体系来培养前列腺癌细胞。在此双层水凝胶结构中的顶层含有肝素修饰的基于透明质酸的水凝胶颗粒，并能够以一定的速率持续释放肝素结合的表皮生长因子样生长因子，而嵌入底层的则是可以从顶部接收生长因子信号的前列腺癌细胞。他们认为，与二维培养的细胞相比，在此系统中培养的肿瘤细胞在mRNA和蛋白水平上显着增加了两种促血管生成因子的表达，即血管内皮生长因子-165(vascular endothelial growth factor-165，VEGF165)和白介素-8(interleukin-8，IL-8)。

2.2 合成支架

2.2.1 聚乳酸(poly lactic acid，PLA)

Polonio等[49]为了建立一种能够使乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells，BCSCs)富集的PLA支架，利用熔丝制造(fused filament fabrication，FFF)3D打印机制作出不同架构的PLA支架并用细胞增殖实验对其评估。他们认为，PLA多孔支架用于体外三维培养乳腺癌细胞可以增加BCSCs的数量。

2.2.2 聚乙二醇二丙烯酸酯(polyethylene glycol diacrylate，PEGDA)

Jabbari等[50]将乳腺癌细胞系(MCF-7和MDA231)、结直肠癌细胞系(HCT116)、胃癌细胞系(AGS)以及骨肉瘤细胞系(U2OS)包埋在压缩模量为2～70 kPa的PEGDA水凝胶中，探究在不受微环境中其他因素干扰的情况下，癌细胞组织来源对PEGDA酯水凝胶中CSCs生长及标记物表达的最佳基质刚度的影响。他们发现， CSCs亚群的生长和标记物表达的最佳基质刚度对于MCF-7和MDA231为5 kPa，对于HCT116和AGS为25 kPa，而对于U2OS则为50 kPa。

2.2.3 纳米粘土聚合物

Molla等[51]利用基于纳米粘土聚合物所构建的体外肿瘤培养系统，模拟了前列腺癌在仿生骨支架上完成骨转移定植的早期阶段。他们首先将人间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)接种在仿生骨支架上，随后它们将分化为成骨细胞，形成矿化骨基质而不含成骨补充剂。 最后，将前列腺癌细胞接种在种有MSCs的支架上。这种“顺序培养”使两种细胞自发的形成肿瘤细胞球体，并具有明显的紧密细胞连接及缺氧核心区域。

3 结 论

本文总结了建立肿瘤相关体外三维培养模型所用的各种方法和材料，及其在乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、骨肉瘤等不同类型肿瘤中的应用进展。无支架体外三维培养技术主要包括液体覆盖法及悬滴法；基于支架的体外三维培养技术主要包括天然支架(藻酸盐、基质胶、胶原、丝素蛋白、透明质酸等)及合成支架(PLA、PEGDA酯、纳米粘土聚合物等)。此外，体外三维肿瘤细胞培养模型可以模拟真实的肿瘤微环境并允许细胞—细胞及细胞—基质间相互作用，在研究肿瘤发病机理，增殖，迁移和抗药性方面优于传统二维细胞培养。然而，如何建立具有高度再现性及高兼容性的体外三维培养模型仍然面临着诸多挑战。