自制Sephadex-G50微柱凝胶卡在布鲁菌血清凝集试验中的应用价值

李 艳， 耿慧娟， 邱思远， 王向华， 王 浩

（保定市人民医院检验科，河北 保定 071000）

布鲁菌病是由布鲁菌（Brucella）感染引起的人畜共患性疾病[1]，一般通过患病动物传播并感染给人类，主要集中在地中海地区、亚洲地区和发展中国家流行。目前，这些地方的布鲁菌病仍然是一个涉及人类健康的、较严重的地方病[2-3]。我国目前仍以简单而廉价的试管凝集试验作为明确诊断布鲁菌病最重要的确证试验之一[4]，然而试管凝集试验操作繁琐、试验时间长、结果判读困难且存在主观差异[5]。微柱凝胶技术是红细胞血型血清学检测新方法，具有操作简便、试验时间短、结果判读清晰客观、易于标准化和自动化等优点[6]。本研究创新性地将微柱凝胶技术应用于布鲁菌病的血清凝集试验中，取得了较好的效果。

1 材料和方法

1.1 样本来源

收集保定市人民医院布鲁菌病门诊以发热、乏力、关节疼痛为主要症状的布鲁菌病疑似患者血清样本160份，阳性质控血清和阴性质控血清购自西班牙Linear公司。

1.2 主要仪器及试剂

布鲁菌染色菌悬液（西班牙Linear公司）、多道电子加样枪（美国Thermo Scientific公司），LB-3000型血型血清学多用离心机（江苏力博医药生物技术有限公司），12 mm×100 mm规格小试管、U型塑料微孔板（江苏康健医疗用品有限公司），0.85% NaCl溶液（石家庄四药有限公司）。

1.3 自制3种微柱凝胶卡

分别称取3种不同类型（G50-Superfine、G50-Fine、G50-Medium，特性区别见表1）Sephadex-G50凝胶（美国GE公司）干粉各1 g，放入20 mL无菌0.85% NaCl溶液中充分混匀，室温泡发24 h（泡发好的交联葡聚糖凝胶颗粒为近圆球形，可以自然沉淀到0.85% NaCl溶液底部）。利用输血科使用过的微柱凝胶抗筛卡（北京乐普公司），将内容物用流水去除，将微柱凝胶抗筛卡洗净、晾干后备用。采用微量加样枪吸取上述3种泡发好的、不同规格的凝胶颗粒混悬液加入空白微柱反应卡中（每管25 μL），然后将微柱凝胶卡放入专用血型血清学离心机中，700×g离心3 min，去除凝胶混悬液中含有的气泡后，贴好标签备用。

表1 不同类型Sephadex-G50凝胶干粉的特性

1.4 试验方法及判定标准

1.4.1 试管凝集试验 按试剂说明书进行操作，以0.85% NaCl溶液作为稀释液，在小试管中将160份实验血清以1∶25～1∶800倍比稀释，然后向每个小试管中滴加50 μL布鲁菌染色菌悬液，使菌悬液的最终稀释度为1∶20倍，充分混匀后37 ℃孵育24 h后，肉眼检查凝集情况，并判定结果。

1.4.2 微柱凝集试验 用0.85% NaCl溶液将布鲁菌染色菌悬液原液稀释10倍制备工作菌悬液。用0.85% NaCl溶液在U型微孔板中将实验血清按1∶12.5～1∶400进行2倍比稀释，每孔液体量为50 μL。将50 μL工作菌悬液加入各孔稀释血清中，并充分混匀，于37 ℃温箱孵育20 min后，将其加入自制的微柱凝胶卡，然后立即使用血型血清学离心机700×g离心20 min。当抗原抗体反应时，细菌会发生凝集，在一定的离心力作用下，凝集的蓝色细菌颗粒不能通过凝胶间隙，被截留在凝胶表层或分散在凝胶当中；而未凝集的蓝色细菌在离心力的作用下，可通过凝胶间隙沉积于凝胶管的底部。

1.4.3 结果判定 参考文献[6-7]进行结果的判读。如果血清中不存在特异性抗体，蓝色布鲁菌抗原会沉淀到微柱凝胶卡底部，判断为阴性；当血清中存在特异性抗体时，蓝色抗原和抗体可形成复合物，离心后仍保留在凝胶上方，判定为阳性。见图1。

图1 微柱凝集试验结果示意图

1.5 质量控制

为验证系统的有效性，并判读结果，每批次试验均同时检测阳性质控和阴性质控。

1.6 统计学方法

以试管凝集试验的结果为金标准，采用SPSS 11.0软件进行统计分析，计算微柱凝集试验的敏感性、特异性、假阴性率、假阳性率、约登指数及符合率，一致性检验采用Kappa检验。

2 结果

2.1 3种自制微柱凝胶卡试验结果

3种自制微柱凝胶卡中，B卡（G50-Fine）试验结果最好，各项评价指标均达到非常满意的程度；A卡（G50-Super fine）特异性为81.72%、假阳性率为18.28%，结果较差；C卡（G50-Medium）的敏感性为46.27%、假阴性率为53.73%、Kappa值为0.50，结果非常不理想。见表2。

表2 3种自制微柱凝胶卡血清凝集试验结果评价

2.2 3种自制微柱凝胶卡与试管凝集试验结果比较

与试管凝集试验结果比较，A卡有60份（37.5%）结果分布在箭头线上，100份结果分布在箭头线上方；B卡有146份（91.25%）结果分布在箭头线上，1份结果分布在箭头线上方，13份结果分布在箭头线下方；C卡有62份（38.75%）结果分布在箭头线上，98份结果分布在箭头线下方；B卡的试验结果与试管凝集试验结果的相关性最好。见图2。

图2 3种自制微柱凝胶卡和试管凝集试验血清凝集滴度测定结果比较

3 讨论

葡聚糖凝胶是一种由葡聚糖与环氧氯丙烷交联而成的球形凝胶。1959年，美国法玛西亚公司就开始制造葡聚糖凝胶，主要利用其分子筛作用，通过凝胶过滤及离子交换色谱分析，进行多肽分离、脱盐、清洗生物提取液、相对分子质量测定等[8]。1990年，LAPIERRE等[9]介绍了一种采用葡聚糖凝胶检测红细胞抗原抗体反应的新技术，目前这种微柱凝胶免疫检测技术主要在红细胞血型血清学检测中常规使用。从微柱凝胶免疫检测技术的原理、本质、特点、优点及其在临床免疫实验诊断很多方面的需要来看，微柱凝胶免疫检测技术不仅能用于红细胞血型抗原抗体检测，还可应用于细菌、病毒等致病微生物的抗原抗体检测。

本研究团队前期在使用商品化血型血清学微柱凝胶卡（北京乐普公司）的研究基础上，采用不同型号的进口葡聚糖凝胶干粉研制专用于布鲁菌血清凝集试验的微柱凝胶卡。将3种进口凝胶干粉制备的不同微柱凝胶卡（A卡、B卡和C卡）与金标准试管凝集试验结果进行同期比对，结果表明：（1）采用G50-Fine干粉制备的A卡，试验敏感性高达100%，假阴性率为0，采用A卡进行凝集试验能保证将所有真阳性标本检测出来；但A卡的不足在于特异性只有81.72%，即其检出的阳性结果有18.28%为假阳性；此外，A卡还有62.5%的试验结果与试管凝集试验的凝集滴度比对结果不理想，超过了试管凝集试验1～3个2倍稀释度。（2）采用G50-Medium制备的C卡虽然特异性达100%，能够将真阴性结果全部检测出来，但是其敏感性仅为46.27%，假阴性率为53.73%、约登指数为0.46、Kappa值为0.5，均不理想，此外还有61.25%的试验结果的凝集滴度低于金标准1～3个2倍稀释度。（3）采用G50-Fine干粉制备的B卡敏感性达到95.52%，假阴性率仅为4.48%，稍逊于A卡，远优于C卡；且其特异性达94.62%，假阳性率为5.38%，稍逊于C卡，远优于A卡；也就是说，B卡既具备A卡的高敏感性，同时也具备C卡的高特异性，可靠性评价分值在3种卡中最高，且B卡所得的试验结果中有91.25%的滴度和试管凝集试验的滴度一致。综合上述结果来看，我们认为在和试管凝集试验的比对中，不论是阴性结果，还是阳性结果，在凝集滴度方面，B卡的试验结果都是3种卡中最优秀的。

单纯就本研究达到的最佳检测效能来说，在试验过程中我们还可以采取联合检测的策略：可以先将所有样本用A卡检出其中的阳性标本，然后再将检出的阳性标本用C卡来排除阴性，这样剩余的阳性标本则是假阳性率和假阴性率均为0的试验结果，然后所有被排除的样本再用B卡检测其阴性、阳性。但在临床实验室中，由于标本量大、试验人员少、检测成本高等因素，使其实现起来较为困难。

3种自制凝胶卡试验结果的差异主要是由于3种原料干粉泡发后形成的球形凝胶的直径不同造成的，球形凝胶的直径与球形凝胶间形成的间隙大小呈正相关，凝胶直径越大，间隙就越大，凝胶直径越小，间隙就越小[10]。3种原料干粉中G50-Superfine泡发后直径最小（20～50 μm），则其球形凝胶间形成的间隙最小；G50-Medium泡发后直径（50～150 μm）在3种凝胶中最大，则其凝胶间隙也最大；G50-Fine泡发后直径（20～80 μm）介于另2种凝胶的之间，则间隙G50-Super fine＜间隙G50-Fine＜间隙G50-Medium。

微柱凝胶免疫检测技术应用在布鲁菌血清凝集试验的核心原理是利用球形凝胶形成的间隙，合理地把布鲁菌抗原与其特异性抗体结合形成的凝集颗粒截留在凝胶的表层。本研究结果表明，以G50-Fine干粉制备的凝胶间隙大小最适合做凝集颗粒的截留，因此B卡的实验结果和金标准相比最好；A卡的凝胶间隙相对偏小，造成一些较小的凝集颗粒也被截留，因此其假阳性率提高到了18.28%；C卡凝胶间隙太大，和布鲁菌血清凝集试验形成的颗粒大小不匹配，无法截留形成的凝集颗粒，因此评价指标都不理想。

以G50-Fine干粉制备的B卡虽然取得了令人满意的结果，但其在截留试管凝集试验为1∶25～1∶100凝集滴度的血清样本时，其结果的相关性和金标准比较相对较差，这主要是由于当血清中特异性抗体滴度较低时，抗原抗体反应中比例失调过大，抗原抗体结合形成的凝集颗粒相对较小[11]，造成凝胶间隙无法截留这部分凝集颗粒。这是本研究中没有解决的问题，下一步我们拟用添加表面活性剂的缓冲溶液来取代本研究中采用的0.85% NaCl溶液，作为凝胶的泡发溶液，以降低凝胶的表面张力，同时提高凝胶溶液的浮力，来提高微柱凝胶卡对低凝集滴度血清的检测能力。

总之，以G50-Fine凝胶干粉制备的微柱凝胶卡非常适用于布鲁菌血清凝集试验，具有试验结果易于判定、准确可靠、试验用时较短等优点，在临床中具有很好的应用价值。