恒温扩增实时荧光检测快速诊断结核性脑膜炎的临床价值

欧维正， 秦 万， 王 琼， 王明栋， 张 娟， 徐 勇， 张廷梅

（贵阳市公共卫生救治中心，贵州 贵阳 550003）

结核性脑膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的最严重的肺外结核病，占所有肺外结核病的5%～10%[1]，发病率高，病死率可达15%～30%[2]。目前，诊断TBM主要依据临床症状和脑脊液检测，其中病原学检测是诊断的金标准。脑脊液样本中MTB载量低，导致抗酸染色法敏感性差，且不能区分MTB和非结核分枝杆菌（nontuberculous Mycobacterium，NTM）；培养法虽然结果精确、可靠，但培养周期为6～8周，易延误治疗。MTB核酸检测技术分为2类：一类是以RNA扩增为基础、以DNA为检测靶标的核酸检测技术，如荧光探针聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），目前国内外商品化的MTB核酸检测试剂多基于此类技术；一类是以RNA扩增为基础、以为检测靶标的核酸检测技术，如恒温扩增实时荧光检测（simultaneous amplification and testing，SAT）。MTB核酸检测技术敏感性高、速度快，目前已被广泛应用于临床。本研究通过比较培养法、PCR和SAT检测脑脊液样本中MTB的效能，评价SAT在TBM诊断中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2017年6月—2018年9月贵阳市公共卫生救治中心疑似中枢神经系统感染的患者496例，其中328例最终临床诊断为TBM（TBM组）[男197例、女131例，年龄（33.5±18.7）岁]；另外168例经临床鉴别诊断排除TBM（对照组）[男100例、女68例，年龄（40.8±20.5）岁]。

1.2 主要仪器和试剂

ABI 7300实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）、Extractor 36核酸快速提取仪（北京博奥生物有限公司）、TL988实时荧光定量PCR仪（西安天隆科技有限公司）、FZP-1核酸提纯仪（上海仁度生物科技有限公司）、K30干式恒温器（上海之信仪器有限公司）等；罗氏固体培养基和对硝基苯甲酸（p-Nitrobenzoic acid，PNB）培养基（珠海银科医学工程有限公司）、分枝杆菌核酸检测（PCR-荧光探针法）试剂盒（北京博奥生物有限公司）、结核分枝杆菌核酸检测（RNA恒温扩增法）试剂盒（上海仁度生物科技有限公司）。

1.3 方法

采集所有患者脑脊液样本约6 mL，分2管送检，1管（约2 mL）用于细菌培养，1管（约4 mL）用于PCR和SAT。

1.3.1 细菌培养 将脑脊液样本直接接种于罗氏固体培养基上，若满8周仍无细菌生长，即报告培养阴性。分离到的菌株参照文献[3]进行PNB试验，如菌株在PNB培养基上生长，则鉴定为NTM，反之鉴定为MTB。

1.3.2 PCR 将约2 mL脑脊液样本按工作手册[4]进行PCR。样本MTB扩增曲线呈S型，且循环阈值（cycle threshold，Ct）＜36判定为MTB-DNA阳性；样本NTM扩增曲线呈S型，且Ct值＜40判定为NTM-DNA阳性；MTB-DNA和NTM-DNA均为阳性时，判为MTB-DNA阳性；MTB-DNA和NTM-DNA均为阴性时，判为无分枝杆菌检出。以试剂盒自带的阴性、阳性对照作为质控。

1.3.3 SAT 将约1.5 mL脑脊液样本加入1.5 mL离心管中，14 170×g离心5 min，弃上清；加入50 μL MTB-RNA稀释液，充分震荡后悬浮，制成待测样本。将待测样本和50 μL阴性对照放入FZP-1核酸提纯仪内（液体要浸在水面以下），超声处理15 min后取出，再14 170×g离心5 min，上清即为提取的RNA。取2 μL提取好的RNA加入含30 μL扩增检测液的洁净微量反应管中，于K30干式恒温器内60 ℃放置10 min，再42 ℃放置5 min，之后保持在42 ℃，加入10 μL SAT酶；采用TL988实时荧光定量PCR仪进行扩增（42 ℃ 1 min，40个循环，每分钟采1次荧光，选取FAM通道）。结果判断：Ct值＜40判定为MTB-RNA阳性，Ct值≥40判定为MTBRNA阴性。以试剂盒自带的阴、阳性对照作为质控。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TBM组和对照组3种方法检测结果

496例脑脊液样本中，培养法分离到37株（7.46%）菌株，经PNB试验鉴定均为MTB。PCR检测检出MTB-DNA阳性22例（4.44%），SAT检出MTB-RNA阳性51例（10.28%）。见表1。

表1 TBM组与对照组3种方法检测结果 例

2.2 以临床诊断TBM为金标准，TBM组和对照组3种方法MTB检测效能比较

SAT检测MTB的敏感性最高（15.24%），与培养法比较，差异无统计学意义（χ2=2.24，P＞0.05）；与RCR比较，差异有统计学意义（χ2=12.23，P＜0.05）。培养法和PCR检测MTB的特异性均为100%，但与SAT（特异性为99.40%）比较，差异无统计学意义（χ2=1.00，P＞0.05）。见表2。

表2 3种方法MTB检测效能

2.3 以培养法为标准，TBM组3种方法MTB检测结果比较

T B M组3 2 8例脑脊液样本中，7 7例（23.48%）检测到MTB。以培养法为标准，SAT的符合率为82.01%，敏感性为37.84%，特异性为87.6%。PCR的符合率为86.89%、敏感性为21.62%、特异性为95.19%。见表3。

表3 TBM组3种方法MTB检测结果比较

3 讨论

TBM属于重症结核病，是结核病患者死亡的主要原因之一。对TBM患者进行早期诊断、规范治疗，可显著降低其致残率、致死率[5]。由于TBM患者病情轻重程度不同、就诊阶段不同、临床表现多样，加之脑脊液实验室检查特征性结果较少，导致确诊TBM的难度较大，但检出脑脊液样本中的MTB仍然是确诊TBM的金标准。

SAT方法是基于转录介导扩增（transcription mediated amplification，TMA）和恒温扩增技术发展起来的一项新的核酸检测技术，其原理是通过设计特异性的MTB核糖体RNA扩增引物及优化探针技术，使用M-MLV反转录酶及极高转录活性的T7 RNA多聚酶同时实现核酸恒温扩增和实时荧光检测，能够快速、直观地反映样本中有无MTB。与传统的基于DNA模板的核酸扩增技术相比，其优点为[6]：（1）对仪器的要求低，操作简便，稳定性和结果准确性高；（2）起始靶标为环境中极易降解的RNA，可有效避免污染；（3）因RNA只在活菌中存在，SAT还可监测疾病活动性及药物疗效；（4）RNA拷贝数比DNA的拷贝数高，并且荧光标记的RNA探针可同步检测扩增信号，提高检测敏感性。

本研究采用培养法、PCR和SAT对脑脊液样本进行同步检测，比较3种方法检测结果，以评估SAT快速检测脑脊液样本中MTB的效能，结果显示，以临床诊断TBM作为标准，SAT检测MTB的敏感性为15.24%，与培养法（11.28%）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），与PCR（6.71%）比较，差异有统计学意义（P＜0.05），与张海晴等[7]的研究结果一致。目前，关于SAT检测脑脊液样本的研究较少，而对其检测痰液、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液等样本的研究[8-9]较多，结果均显示SAT对这些样本中的MTB有较高的检测敏感性，并优于培养法。本研究采用的3种方法在操作上均无需对脑脊液样本进行前处理，保证了3种方法检测前样本的一致性，增加了检测结果的可比性。但因脑脊液载菌量低、取样量少，抗结核药物治疗后脑脊液细菌负荷量迅速下降[10]等因素，往往导致MTB检测敏感性不高。2009年，英国感染学会建议TBM患者在抗结核药物治疗前留取不少于6 mL的脑脊液进行细菌学检查，并且在检测前将脑脊液样本3 000×g离心至少20 min[11]。

本研究结果显示，SAT检测MTB的特异性为99.40%，略低于培养法和PCR（100%），但差异均无统计学意义（P＞0.05）。SAT和PCR同属于分子生物学检测方法，控制实验室污染是检测成功的关键。2000年，BARAN等[12]指出，SAT虽然具有一定的检测效率，但仍然存在一定的假阳性率与假阴性率。尽管SAT检测的RNA易降解，但操作不当仍然可能会造成污染。本研究SAT检测出现1例假阳性，提示该技术在操作过程中应严格遵守各项规范，避免人为因素降低其检测效能。

本研究结果表明，培养法MTB阳性检出率与SAT差异无统计学意义，与PCR差异有统计学意义。SAT对脑脊液MTB的检测效果更接近培养法，优于PCR和SAT，有明显的快检优势。

RNA降解快，如果患者的脑脊液含菌量不多，而SAT操作时间控制不当，如放在核酸提纯仪中超声处理留置时间过长，也可能会造成SAT对MTB的检出率下降[13]；另外，若样本中或容器内存在核酸扩增抑制剂，检测出现假阴性的可能性会增加[14]。这些均可能导致部分结果培养法为阳性，而SAT检测阴性。

本研究结果表明，3种方法脑脊液MTB阳性总检出率为23.48%，优于单一使用任一方法。目前，尚无一种可快速、准确地诊断结核病的方法，采用SAT、PCR等快速分子诊断技术联合传统的培养方法，不仅可以提高诊断率，还可以缩短诊断周期，为临床对结核病的诊治提供更准确、更快速的依据。

综上所述，SAT能快速检测脑脊液中的MTB，敏感性较高，可用于对TBM患者进行早期诊断。3种方法联合检测可提高脑脊液MTB的阳性检出率。