磁性微柱阵列制备及驱动研究*

许婧怡，张 帆，2*

(1.北京信息科技大学光电测试技术及仪器教育部重点实验室，北京 100192；2.北京信息科技大学先进光电子器件与系统创新引智基地，北京 100192)

细胞是生物体基本的结构和功能单元，始终处于不同的力学环境中[1-2]。 细胞能感知其周围的力学刺激，如细胞外基质刚度、拉压应力、流体剪切应力等，并对所受刺激做出响应。 对于在体外研究细胞响应来说，包括两个方面，一方面是对细胞施加力学刺激，另一方面是对其做出的响应进行观测。

迄今为止，已经开发了各种微机电系统(MEMS)用于研究细胞对机械刺激的响应[3]，在开发的各种MEMS 器件中，由聚合物或复合材料制备而成的微柱器件，因其可控性好，所需的图像处理与力学模型较为简单，并且生物兼容性较好[4-6]，而在微纳米技术研究中获得了极大的关注[7-8]，成为细胞力学领域最有潜力的方法之一[9]。 微柱器件大部分由微米到纳米级的微柱阵列组成，可以分为两种不同的类别，第一类是无源微柱阵列，即器件上没有驱动机构，它主要用作传感器件；第二类是可驱动微柱阵列，即可同时作为驱动器件和传感器件使用，由于磁性材料受环境限制较小[10]，所以现在大多数可驱动聚合物微柱阵列都是采用磁性驱动的[3]。 磁性微柱阵列的制备大致可分为溶剂型铸造技术法[8]、纳米线沉积法[11-12]和干性纳米颗粒法[8]。 但现有的磁性微柱阵列制备方法仍存在一些问题。 其中溶剂型铸造技术是制备磁性聚合物结构最常用的方法之一[7-8]，但是由于磁性纳米颗粒的表面积与体积之比较大，为了使表面能最小化而倾向于团聚[13-14]，使得磁性纳米颗粒在流体介质中均匀分散是很有难度的，故使用该方法制备小尺寸微柱阵列填充率较低，不便于对细胞施加均匀力学刺激；纳米线沉积法是Sniadecki N J 在2007 年提出的，该方法可以将磁性微柱的尺寸制备得较小，但制备工艺较为复杂，嵌入率低，不能够实现全场内的均匀驱动；干性纳米颗粒法是比较便捷的一种方法，2012 年，Khademolhosseini F 等将干纳米磁性颗粒涂抹在阴模上，使用永磁体将颗粒吸入阴模微洞中，二次铸模后得到磁性微柱阵列最小直径为8 μm，高度为18 μm，对于平均大小在几十纳牛的细胞牵引力来说，所能得到的偏转量小于200 nm，使用一般光学显微镜很难观测。 所以，如果想要能够使用磁性微柱阵列对细胞施加均匀力学刺激并进行测量的话，必须制备小尺寸磁性微柱阵列。

使用单一聚合物成分(如聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS))微柱阵列测量细胞响应时，由于微柱整体透明，微柱阵列顶端在显微图像中呈现圆形亮斑状，经过简单图像处理后，使用形态学方法解算微柱圆心的质心坐标偏移量即可获得微柱的位移矢量。 但是磁性微柱阵列不透光，微柱整体在显微图像中呈现黑色，故微柱偏移时，顶面圆心坐标不容易使用常规方法提取。

本文针对现有磁性微柱阵列制备工艺的不足，提出了一种使用干性纳米颗粒法制备小尺寸磁性微柱阵列的方法，并通过永磁体对其进行驱动，实现了较小磁场下磁性微柱阵列的偏转，针对磁性微柱顶面圆心坐标不容易使用常规方法提取的问题，提出了适用于磁性微柱阵列偏转的图像处理算法。

1 实验部分

1.1 磁性微柱阵列修饰比率及刚度研究

使用多物理场仿真软件COMSOL Multiphysics(COMSOL Inc.，瑞典)建模，研究磁性微柱偏转的可见性以及磁性微柱的刚度。 在此研究中，将磁性部分使用实际相同直径的200 nm 磁性微球进行一定磁场下的偏转仿真，验证是否能够满足一般光学显微镜的成像分辨率，然后对磁性微柱进行模拟细胞力的仿真，得到磁性微柱的刚度。

1.2 小尺寸磁性微柱阵列制备及驱动

1.2.1 实验材料及仪器

主要材料及试剂:PDMS 购自美国Dow Corning公司；SU-8 光刻胶购自美国Microchem 公司；1H，1H，2H，2H-全氟辛基-三氯硅烷(以下简称硅烷)购自美国Sigma-Aldrich 公司；四氧化三铁纳米颗粒购于中国中科雷鸣公司。

主要仪器设备:真空干燥箱(DZF-6020，上海一恒科技仪器有限公司，中国)、紫外臭氧清洗机(LXY - PL16，SEN Inc.，日 本)、超 声 波 清 洗 机(JP-010S，深圳市洁盟清洗设备有限公司，中国)、倒置显微镜(Eclipse Ti-U，Nikon Instruments Inc.，美国)、60 倍油浸物镜(MRD01605，Nikon Instruments Inc.，美国)、环境扫描电子显微镜(以下简称电镜)(Quanta200，FEI Inc.，荷兰)。

1.2.2 磁性微柱的制备方法

制备小尺寸磁性微柱阵列采用软光刻技术[15]，用二次铸模法制备。 制备磁性微柱的材料是PDMS和粒度为200 nm 的四氧化三铁颗粒。 为了满足高倍物镜焦距短的成像要求，使用二次铸模工艺制备磁性微柱阵列，得到以盖玻片为基底且满足60 倍物镜成像工作距离的磁性微柱阵列，其工艺流程图如图1 所示，为便于理解，对磁性微柱阵列尺寸比例进行了夸大处理。

图1 磁性微柱阵列制备流程

在制备磁性微柱阵列时，首先根据设计好的图案制作光刻掩膜版，对旋涂在硅片上的SU-8 光刻胶通过光刻掩膜版进行紫外曝光、显影[16-17]后，得到直径为3 μm、高度为9 μm、中心间距为9 μm 的SU-8 光刻胶垂直悬臂梁阵列硅片。 然后对硅片模具进行12 h 的硅烷化处理，在微柱表面形成一层硅烷薄膜，以便于一次脱模，延长硅片模具的使用寿命。 处理后，将PDMS 预聚物与固化剂按照10 ∶1 的比例混合均匀，置于真空干燥箱中抽气，除去其中的气泡。 将抽气后的PDMS 混合物浇铸在硅模具表面，在110 ℃下固化30 min，脱模后得到PDMS 微洞模具，即阴模。同样，对阴模也进行硅烷化处理，使阴模表面也形成一层硅烷薄膜，避免二次铸模时PDMS 之间的键合，保证后续脱模成功。 然后，将阴模切割成为所需大小，将干燥的磁性纳米颗粒机械性导入阴模，将其放置在钕铁硼磁铁上，使颗粒可以进入微洞中，一段时间后将多余颗粒除去，然后在其表面均匀涂覆约20 μL 的PDMS 混合物，再次置于真空干燥箱中除气，之后将其倒扣在经紫外臭氧清洗机活化了30 min的盖玻片表面，轻轻按压阴模，挤出多余的PDMS 混合物。 将其放置在磁场强度约为0.16 T 的钕铁硼磁铁中间，50 ℃下磁化3 h，除去磁铁后，将其再次放入干燥箱中110 ℃固化，18 h 后取出，脱模得到直径为3 μm 的小尺寸磁性微柱阵列。

使用设计的结构，将钕铁硼永磁体使用光学杆架在显微镜载物台上对磁性微柱阵列进行驱动。 驱动示意图如图2 所示，即驱动方向与磁化方向正交。

图2 磁性微柱阵列驱动示意图

1.3 磁性微柱阵列图像识别算法

使用数学软件MATLAB(MathWorks Inc.，美国)对所获得的一系列磁柱驱动图像进行基本的灰度变化、滤波、二值化等处理后，利用霍夫变换提取偏移前后顶面圆的圆心坐标[18-20]，两者作差，即可获得微柱的位移矢量。 算法流程图如图3 所示。

图3 磁性微柱偏移算法流程图

2 结果与讨论

2.1 磁性微柱阵列刚度分析

在此研究中，采用在PDMS 微柱中嵌入磁性微球的方式对磁性微柱进行仿真分析，仿真所用微球直径与实际实验所用直径相同，为200 nm，对其进行固体力学与无电流磁场仿真，对于正常体积的永磁体来说，磁场大小基本在0.5 T，故在仿真时在x正方向施加0.5 T 的磁场，此时仿真情况为理想情况，即磁场仅在x方向存在，得到0.5 T 磁场下磁性微柱的偏转情况，仿真结果如图4 所示。

图4 内嵌多个磁性微球的微柱及磁场驱动偏转示意图

由图4 可以看出，当外加磁场的磁场强度为0.5 T时，可以得到136 nm 的偏转量，需要说明的是，由于仿真时受仿真条件限制，所嵌入微球数量有限，实验中磁性微球嵌入数量远多于仿真情况，故在实际实验中所得到的偏转量也更大，所以仿真结果得到的位移小于实际情况。

微柱除受磁场力作用外，还会受到细胞对微柱顶端施加的牵引力。 本文还对磁性微柱进行了固体力学仿真，首先在微柱底端增加固定约束，然后对磁性微柱的上表面施加0～80 nN 的力来模拟细胞所产生的细胞牵引力，得到磁性微球修饰的微柱的力学应力应变曲线，如图5 所示。 由关系图可以看出，磁性微柱偏转的位移均与受力在0～80 nN 范围内呈线性关系，计算可得，磁性微球修饰的磁性微柱刚度为54.31 nN/μm。细胞在响应外界刺激并发生收缩、迁移等行为时，能够拉动微柱的刚度大约为数十纳牛每微米，故对于磁性微柱来说，是可以测量细胞的响应的。

图5 磁性微球修饰微柱力学应力应变曲线

2.2 磁性微柱阵列制备结果

使用上述方法制备以盖玻片为基底的磁性微柱阵列，样品边长约为5 mm，如图6(a)所示。 与2007年，Sniadecki N J[11]所提出的使用纳米线法制备的磁性微柱相比，方法简单易操作，并且嵌入率高，能够得到显微镜视场范围内均匀的磁性微柱阵列。

图6 磁性微柱阵列样品

在对活细胞施加力学刺激并测量其响应时，为了能够清晰地观测细胞，通常使用60 倍及以上的高倍物镜进行观测。 但是显微镜的倍数与工作距离有着天然的制约关系，物镜倍数越高，工作距离越小，故需要将磁性微柱阵列制备得较薄来满足高倍物镜成像工作距离的要求。

实验中使用的60 倍油浸物镜的工作距离为0.13 mm，观测时推荐使用0.17 mm 左右厚度的盖玻片为样品基底。 对本文加工的薄微柱阵列样品进行60 倍油浸物镜的显微观测，如图6(b)所示，可以看到成像清晰，对比度良好。 使用扫描电子显微镜对磁性微柱阵列进行成像，如图6(c)所示，可以看到磁性微柱直径约3 μm，中心距为9 μm。 并且，从磁性微柱阵列的扫描电子显微图可以看出，利用二次铸模工艺制备的以盖玻片为基底的磁性微柱阵列除有部分未拔出外，排列均匀、大小均一。

在磁性微柱阵列制备时，硅烷化的情况对于后续制备有一定影响，所以硅烷化对于磁性微柱阵列制备来说是十分重要的。 首先需要对硅片进行硅烷化，目的是便于一次脱模，并延长硅片模具的使用寿命，然后使用PDMS 制备阴模。 阴模制备完成后也要进行硅烷化处理，目的是便于二次铸模后顺利脱模。 但是硅烷化对于硅片和阴模都是有影响的:如果硅片多次硅烷化，会对硅片有一定的损伤；阴模多次硅烷化后，微洞尺寸会逐渐减小，使得微柱尺寸不准确的同时也不便于二次脱模，降低微柱成品率。硅烷化的时间建议在12 h 以上，这样能够使得在硅片或者阴模上能够形成一层均匀致密的硅烷层。

在磁性微柱阵列制备中，最重要的就是磁性纳米颗粒的磁化问题。 对于硬磁材料来说，磁化后的剩磁是使其具有磁性的必要条件，但对于四氧化三铁这种软磁性材料来说，磁化后的剩磁会很快流失，所以对于四氧化三铁来说，磁化过程的主要作用是使磁性纳米颗粒存在一定的排布。 在2020 年，Jeon J[10]的文章里提到各种磁性颗粒磁化的排布对于磁性微柱驱动的影响，当驱动方向与磁性纳米颗粒的排布垂直时，微柱偏转的角度最大。

磁性纳米颗粒首先在填入阴模后就要进行磁化，使其能够进入阴模；其次，在二次铸模完成后，就要再次进行磁化，目的是为了使得磁性纳米颗粒能够在PDMS 中形成与磁化磁场方向一致的排布。 便于后续使用与磁化磁场方向正交的磁场进行驱动。磁化过程中，温度不宜过高，要保证PDMS 处于流动状态。 较低的温度可以降低PDMS 的收缩速度，防止PDMS 中滞留气泡的膨胀，使得PDMS 能够完全包裹磁性颗粒。

2.3 磁性微柱阵列驱动及偏转识别

使用磁场强度约为0.32 T 的永磁体对磁性微柱阵列进行驱动，驱动后如图7(a)所示。 对图像进行二值化，能明显看到微柱整个呈现椭圆状，如图7(b)所示。 在截取区域原图像上标明圆心坐标，如图7(c)所示。 由于驱动时永磁体磁场方向为右上，能够看到磁性微柱随着永磁体的靠近，即磁场增强的情况下，偏转量逐渐增大，偏移情况如图7(d)所示。 其中箭头表示位移偏移矢量，箭头长短代表的位移偏转量的大小，箭头方向代表偏转的方向，最大偏移量为0.589 μm。

图7 磁性微柱算法处理图

磁性微柱的驱动方式有很多，最便捷的方式是使用永磁体，这也是大多数论文中所提到的驱动方法。 如Khademolhosseini F[3]等使用飞轮和连杆将电机轴的旋转运动转化为轨道导轨上磁铁座的正弦往复运动，插入磁铁座的永磁体对盘片底部的迁移芯片施加磁场；Jeon J[10]等使用电动位移台来控制两个圆形永磁体之间的距离，对磁性微柱进行驱动。本文采用自行设计的结构夹持永磁体，通过光学杆连接在光学平台，调节光学杆的位置使永磁体靠近磁性微柱阵列，进行驱动。

使用永磁铁驱动磁性微柱的研究中，通常使用的磁场强度在0～0.6 T，与2007 年Sniadecki N J 所使用0.31 T[11]、2012 年Khademolhosseini F 所 使 用 的0～0.35 T[8]以及2020 年Jeon J 组所使用的0.05 T ～0.6 T[10]的磁场强度相近，对于小尺寸磁性微柱阵列来说，测量牵引力和施加力学刺激的空间分辨率更高，更利于细胞铺展和生长。 其次，磁性微柱尺寸小，驱动时所需磁场小，所需永磁体体积也小，从而可控性好，进而实验测量时环境更稳定、安全。 本文使用干性纳米颗粒法所制备的磁性微柱直径为3 μm，且磁性颗粒分布较匀，所需磁场在0.32 T 左右。 在实验中若使用磁场大的永磁体，磁力很强，实验时候需要特殊的夹持装置来控制永磁体，并且容易对显微镜上的铁磁性材料产生影响，影响实验效果。

与普通PDMS 微柱图像处理相比，磁性微柱阵列与基底对比度高，微柱顶面的成像质量较好，但由于侧壁和顶面均呈现黑色，在微柱发生偏转时呈椭圆形，本文提出采用霍夫变换提取圆心的方法对磁性微柱顶端偏转进行识别，可以实现在同一张显微照片上分别识别微柱顶、底面的圆心，进而便于计算微柱的偏移。

当微柱偏移量较大时，会识别出多个圆。 对于霍夫变换识别多个圆的情况，首先可以通过调节霍夫变换参数，即半径步长、角度步长、半径最大值、半径最小值和阈值来使算法只识别微柱底面和顶面的两个圆。 其次，根据实际情况(如驱动方向)，若识别到的圆与驱动方向相反，则直接剔除；若偏转方向与驱动方向一致，则保留偏转量最大的圆。

3 结论

提出了一种使用干性纳米颗粒，采用二次铸模法制备，能够满足高倍镜成像的以盖玻片为基底的，小尺寸磁性微柱阵列的制备方法，制备了直径为3 μm、以盖玻片为基底的磁性微柱阵列。 通过仿真研究了在模拟不同细胞力的情况下磁性微柱的偏转情况，得到其刚度为54.31 nN/μm。 实验使用永磁体对磁性微柱阵列进行驱动，采用霍夫变换解决了磁性微柱阵列不透光，微柱整体在显微图像中呈现黑色，偏移时顶面圆心坐标不容易使用常规方法提取的问题，对磁性微柱阵列的偏转进行识别，得到了较小磁场下的微柱偏移量。 为对细胞在体外施加力学刺激并进行原位测量提供了新的思路。