汉中市食源性沙门菌的分布及耐药性分析

汤 进， 马国柱， 黄晓霞， 陈雅莉， 孔花娟， 柏 莹， 李景源， 郑春梅

（1. 汉中市中心医院检验科，陕西 汉中 723000；2.陕西省疾病预防控制中心，陕西 西安 710000；3.汉中市疾病预防控制中心，陕西 汉中 723000）

沙门菌属是肠杆菌科中一类分布广泛、血清型多、抗原复杂的肠道致病菌，为人畜共患病原，是引起感染性腹泻和食物中毒的重要致病菌，在临床上引起的常见疾病包括伤寒、副伤寒、胃肠炎和食物中毒。世界卫生组织发布的数据显示，2010—2015年，在5.82亿例合计22种不同食源性肠道疾病患者中，死亡35万余例，其中沙门菌引起的食源性肠道感染5.2万例，致病性大肠埃希菌引起的食源性肠道感染3.7万例，诺如病毒引起的食源性肠道感染3.5万例[1]，沙门菌成为食源性致病菌的重点监控细菌[2]。我国居前5位的致病微生物性食物中毒由高到低分别为：沙门菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌[3]，每年由沙门菌引起的食物中毒事件占全部食物中毒事件的40%～60%[4]。本研究对2018年汉中地区食源性沙门菌的分布及其耐药性进行分析。

1 材料和方法

1.1 一般资料

选取2018年被确诊为食源性疾病引起腹泻且从其粪便样本中分离出沙门菌的患者53例，其中汉中市中心医院24例、汉中市人民医院7例、汉中市3201医院22例。

1.2 仪器与试剂

沙门菌显色培养基（上海科玛嘉公司）、SC增菌液、XLD琼脂平板、麦康凯琼脂平板和MH平板（广州迪景公司），药物敏感性试验纸片（温州康泰公司）、沙门菌血清分型试剂（杭州天润公司、泰国S&A公司）。WalkAway plas全自动细菌鉴定仪（美国贝克曼公司）、全自动细菌鉴定仪（美国BD公司）、API手工鉴定系统（法国生物梅里埃公司）。CHEF-mapper型脉冲场凝胶电泳仪及配套设备（美国Bio-Rad公司）、凝胶成像系统（法国VL公司）。溶菌酶、苯甲基磺酰氟（美国Sigma公司），蛋白酶L（德国Merck公司），限制性内切酶XbaⅠ、电泳级琼脂糖（美国Promega公司），低熔点琼脂糖（美国Bio-Rad公司）。质控菌株伤寒沙门菌（CMCC 50071）、大肠埃希菌（ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、粪肠球菌（ATCC 29212）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213、ATCC 25922）及标准菌株购自温州康泰公司。

1.3 菌株鉴定及体外药物敏感性试验

按细菌性腹泻临床实验室诊断操作指南（WS/T 498-2017）要求采集患者使用抗菌药物前粪便样本。将样本分别接种于SC增菌液、哥伦比亚血琼脂平板、XLD琼脂平板和麦康凯琼脂平板，35℃培养24～72 h。采用全自动细菌鉴定仪和API手工鉴定系统进行细菌鉴定，并通过沙门菌血清分型试剂进行确认。测定待检菌株的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），参照美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2018-M100-S28文件要求进行体外药物敏感性试验和结果判定。所有鉴定和体外药物敏感性试验均采用标准质控菌株进行室内质控。

1.4 脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分型

挑取单个菌落，接种于3 mL的LB肉汤，37 ℃震荡培养16 h，16 000 ×g离心1 min，弃上清，加细胞悬浮液，重复2次，与等体积的2%低熔点琼脂糖混匀，将混合物加入模具孔中，待其凝固后加溶菌酶、蛋白酶K，待胶块透明后浸入TE缓冲液中，4 ℃保存。切取胶块，加入1 μL限制性内切酶 XbaⅠ，37 ℃过夜酶切后，将胶块及Maker放入1%的琼脂糖凝胶孔中电泳。电泳条件为：0.5×TBE电泳缓冲液、冷却温度14 ℃、6 V、120 ℃、5～45 s、26 h。电泳结束后，凝胶用溴化乙锭染色20～30 min，脱色15 min，紫外灯下观察结果。

1.5 统计学方法

采用Whonet 5.6软件及SPSS 13.0软件进行统计分析，计数资料采用例或率表示，比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学差异。

2 结果

2.1 沙门菌血清型和耐药性分析

分离出的53株沙门菌中，包括7种血清型：鼠伤寒沙门菌（26株）、肠炎沙门 菌（13株）、斯坦利沙门菌（6株）、伦敦沙门菌（3株）、汤卜逊沙门菌（2株）及埃森沙门菌（1株）。所有菌株均对哌拉西林的耐药率最高（97.74%），对四环素和氨苄西林的耐药率分别为65.81%和55.03%；对美罗培南、厄他培南、莫西沙星、亚胺培南的耐药率均为0；对碳青酶烯类和氟喹诺酮类抗菌药物的耐药率均＜10%，对氨基糖苷类和头孢类抗菌药物的耐药率为10%～30%。肠炎沙门菌对四环素的耐药率仅为7.70%，远低于其他6种血清型（65.81%～100%）。

2.2 PFGE分型及聚类分析结果

采用PFGE对分离的肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌进行分型，结果用 BioNumerics（5.1）软件进行聚类分析，相似性100%的PFGE指纹谱带型的鼠伤寒沙门菌只有3组，每组2株菌。肠炎沙门有3组，其中1组有7株菌，其余2组均为2株菌。见图1、图2。

图1 鼠伤寒沙门菌PFGE分型及聚类分析

图2 肠炎沙门菌PFGE分型及聚类分析

2.3 食源性沙门菌感染患者性别和年龄分布

53例患者中，男性29例、女性24例，男性、女性差异无统计学意义（P＞0.05）；0～3岁患者31例（58.4%），3～14岁患者10例（18.9%），14～65岁患者2例（3.8%），65岁以上患者10例（18.9%）。其主要感染人群为婴幼儿和14岁以下儿童（77.3%），其次为65岁以上人群（18.9%），65岁以下的成年人仅占3.8%。

3 讨论

沙门菌感染与机体免疫力高度相关，本研究中的53例食源性沙门菌感染患者中，14岁以下及65岁以上者占96.2%，提示这些人群相对免疫力较弱，易发感染。

本研究分离出的53株沙门菌中，包括7个血清型，居前3位的分别是鼠伤寒沙门菌（26株，49.05%）、肠炎沙门菌（13株，24.52%）、斯坦利沙门菌（6株，11.32%），与谭南等[5]的研究结果一致，但与刘翔等[6]的研究结果有差异，提示食源性沙门菌感染有地域特点。

本研究结果表明，沙门菌对碳青酶烯类和氟喹诺酮类抗菌药物的耐药率均＜10%，对氨基糖苷类和头孢类抗菌药物的耐药率为10%～30%，与王宵雪等[7]的报道一致。沙门菌对哌拉西林、四环素和氨苄西林的耐药率较高，分别为97.74%、65.81%和55.03%，明显高于王宵雪等[7]报道的北京地区的23.26%、11.63%和20.09%。但肠炎沙门菌对四环素的耐药率仅为7.70%，远低于其他6种血清型，这是汉中地区沙门菌耐药性的一个特点。

PFGE分型技术分辨率高、重复性好，为确定菌株之间的亲缘关系提供了可靠的技术手段，被广泛认为是细菌流行病学研究的“金标准”[8-10]。本研究对分离的26株鼠伤寒沙门菌进行PFGE分型和聚类分析，发现其谱型相似度为58.20%～100%，但分别来自不同医院，且分离出的其余各株菌相似度均不到100%，提示鼠伤寒沙门菌在汉中地区以散发为主。对分离出的13株肠炎沙门菌进行PFGE分型和聚类分析，发现有3组谱型相似度为100%，这3组具有同源性的菌株分别来自3家医院，提示汉中地区肠炎沙门菌感染具有一定同源性。经过对临床病例的回顾性分析发现，这13例患者中有7例在发病前有食用禽蛋类食品史，禽蛋类食品是沙门菌较易污染的食品种类[11-12]，故被污染的禽蛋类食品极有可能是其传播途径。

如果本研究结果能结合流行病学调查结果进一步分析，对汉中地区食源性沙门菌的感染和预防将起到更大的作用。