肌酸激酶MM同工酶在新生儿杜氏肌营养不良症筛查中的应用

王燕敏， 田国力， 纪 伟， 张潇分

（上海市儿童医院新生儿筛查中心，上海 200040）

杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是进行性肌营养不良症中最常见也是病情最严重的一种遗传病，男性新生儿的发病率为1/6 000～1/5 000[1]。DMD是由于X染色体上编码抗肌萎缩蛋白基因突变，导致抗肌萎缩蛋白缺失或缺陷，起病较隐匿，女性多为携带者，男性患者多于3～5岁起病，常表现为进行性加重的肌无力、肌萎缩及站立困难，10～12岁出现站立或行走困难，只能靠轮椅行动，20岁时需要辅助呼吸，30～40岁时因呼吸或心力衰竭而死亡。在DMD患儿出现临床症状前进行诊断，结合多学科的综合评估和管理，可极大延长患者独立行走的时间和生存期，提高患者的生存质量[2-3]。英国、德国、美国等国家已进行新生儿DMD筛查，以肌酸激酶（creatine kinase，CK）作为筛查指标，若呈阳性则召回患儿进行DMD基因检测[4]。肌酸激酶MM同工酶（creatine kinase isoenzyme MM，CK-MM）是骨骼肌中CK的主要同工酶形式，其在DMD患者中更具特异性[5]。本研究拟评估CK-MM用于DMD筛查的可行性，为今后广泛开展新生儿DMD筛查提供依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

1.1.1 男性新生儿滤纸干血片样本 收集2019年6—10月上海市儿童医院新生儿筛查中心进行遗传病筛查的男性新生儿滤纸干血片样本7 035份，男性新生儿出生体质量为3 373（1 100～5 490）g，母亲孕周为39（28～43）周，采血时间为出生后4（2～6）d。按美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）C28-A3c文件的要求，将所有检测结果进行排序，以低于第97.5百分位数（P97.5）者作为正常对照组。本研究经上海市儿童医院伦理委员会审查批准，受检者直系亲属均签署知情同意书。

1.1.2 DMD患儿 选取2016年3月—2019年7月于上海市儿童医院确诊的DMD患儿25例，其中男24例、女1例，年龄2个月～12岁。患儿临床表现为双下肢无力、易摔倒、步态异常、心肌酶谱异常、进行性肌营养不良、肌源性损伤等。实验室诊断标准[6]：血清CK异常，多重连接依赖式探针扩增技术（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA）、医学外显子组序列和拷贝数分析后确认为DMD基因缺失、增加或变异。在患儿进行相关遗传咨询时，本着自愿的原则，获得患儿父母知情同意后采集患儿外周血样本。

1.2 方法

采集所有对象微量血，滴于S&S903滤纸上，室温下自然晾干，-20 ℃冰箱保存待检。取3 mm直径血斑统一检测。

Genetic Screening Processor 2021全自动荧光免疫分析仪及配套CK-MM测定试剂盒（时间分辨荧光法）、Panthera-Puncher 9打孔仪均购自美国PerkinElmer公司。严格按仪器和试剂说明书进行操作。

1.3 CK-MM检测原理

采用固相双抗体双位点荧光免疫法检测CKMM。微孔板上固相小鼠单克隆抗体和铕离子标记的小鼠单克隆抗体可识别CK-MM分子表面2个独立的抗原位点并发生结合反应，未结合的标记从板孔中冲离。加入诱导剂将已结合的铕离子从微孔板上洗脱并与诱导剂中的成分形成具有高荧光强度的螯合物。该螯合物的荧光强度与滤纸干血片样本中的CK-MM浓度呈正比。

1.4 DMD诊断流程

若滤纸干血片样本的CK-MM检测结果高于筛查人群的P97.5[7]，判定为筛查阳性，需进一步采集静脉血检测血清CK，如血清CK＞200 U/L判定为异常，随后行MLPA、医学外显子组序列和拷贝数分析，若有DMD基因缺失、增加或变异则确诊为DMD。

1.5 方法学评价

1.5.1 精密度 取CK-MM试剂盒提供的低值（138 ng/mL）、中值（402 ng/mL）和高值（1 660 ng/mL）质控样本，每份样本各测定20次，计算批内变异系数（coefficient of variation，CV）；每份样本各测定4次，连续测定5 d，计算批间CV。

1.5.2 正确度 取低值（138 ng/mL）、中值（402 ng/mL）和高值（1 660 ng/mL）质控样本，复孔检测，重复测定15次，计算均值与靶值的偏移。

1.5.3 线性范围 取试剂盒提供的已知浓度的校准品（8 000 ng/mL），取直径3 mm的血斑样本，按1、1/2、1/4、1/8血斑制作系列浓度样本，每份样本重复检测2次。以理论值为X，实测值均值为Y，计算回归方程和r值。

1.6 统计学方法

采用Excel 2010软件及SPSS 19.0软件进行统计分析。采用单样本K-S检验进行正态性检验。非正态分布资料以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估CK-MM筛查DMD的效能。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 时间分辨荧光法检测CK-MM的方法学评价

2.1.1 精密度结果 低、中、高值样本的批内CV分别为9.89%、7.08%、7.27%，批间CV分别为8.35%、7.13%、7.37%，均＜10%。见表1。

表1 时间分辨荧光法检测CK-MM的精密度结果

2.1.2 正确度结果 低值、中值、高值样本的偏移范围分别为-9.34%～12.79%、-10.27%～12.23%、-10.15%～13.51%，均在±15%之间，平均相对偏移分别为0.32%、-1.09%、0.80%。见图1。

图1 时间分辨荧光法检测CK-MM的偏移分布

2.1.3 线性结果 以实测均值为Y，系列理论值为X，进行线性回归分析，线性范围为6.8～8 780 ng/mL，回归方程为Y=1.045 8X+1.929 6（r=0.999 9，P＜0.01）。实测均值与理论值高度相关，线性良好。

2.2 新生儿筛查结果

7 035 名男性新生儿的CK-MM浓度范围为8.68～7 271.91 ng/mL，数据呈正偏态分布（P＜0.000 1）。CK-MM中位数为93.06 ng/mL，主要分布范围为8.68～400.00 ng/mL，占总样本数的96.49%，＞400 ng/mL的累积百分比增长趋缓。见图2。

图2 7 035名男性新生儿滤纸干血片样本CK-MM浓度分布及累积百分比

按CLSI C28-A3c文件的要求，以P97.5的值（713 ng/mL）为初始临界值，7 035名男性新生儿中有6例（0.085%）CK-MM≥713 ng/mL（筛查阳性），均值为2 189.02 ng/mL，范围为713.33～7 271.91 ng/mL；有7 029名CK-MM＜713 ng/mL（正常对照者），数据呈正偏态分布（P＜0.000 1），为91.93（60.16～139.65）ng/mL。

6例筛查阳性患儿召回后进行血清CK检测，4例结果正常，排除DMD；2例CK结果分别为3 270、13 100 U/L，检测DMD基因，均为半合变异，基因型分别为c.1990C＞T（p.Gln664*）和c.7657C＞T（p.Arg2553*），确诊为DMD。CK-MM筛查新生儿DMD的阳性预测值为33.33%（2/6），男性发病率为1∶3 518。

2.3 CK-MM诊断DMD的效能评价

27例DMD患儿（25例DMD患儿，2例筛查确诊患儿）的基因检测结果分别为半合缺失21例、拷贝数增加1例、女性杂合缺失1例、半合变异4例。DMD患儿CK-MM浓度为6 169.69（2 361.13～8 301.66）ng/mL，明显高于正常对照组[91.93（60.16～139.62）ng/mL]（P＜0.000 1），是正常对照组的67倍。27例DMD患儿CK-MM、CK及基因检测结果见表2。

ROC曲线分析结果显示，以正常对照组为对照CK-MM诊断DMD的曲线下面积（area under curve，AUC）为1.0，最佳临界值为762 ng/mL，敏感性为100%，特异性为99.94%。见图3。

表2 27例DMD患儿CK-MM、CK及基因检测结果

图3 CK-MM诊断DMD的ROC曲线

3 讨论

DMD是最常见的X连锁先天性肌病，至今无治愈手段。近年来，随着药物治疗、基因治疗、骨髓干细胞移植等取得的重大进展，DMD逐步受到临床关注[8-9]。有研究结果显示，早期使用糖皮质激素可有效改善患者的运动功能，提高患者的生存质量和存活时间[6]。因此，在新生儿期对DMD进行筛查可以早期诊断，尽早治疗，结合心脏、呼吸、骨骼和康复等多学科干预可显著提高患者生活质量，延缓疾病进程，延长患者生存期，还能为有先证者家庭的下一胎产前诊断提供帮助。据美国医学协会的报道，1975—2011年间全球有1 800万新生儿接受DMD筛查，确诊344例DMD[10]。1990—2011年间，英国威尔士地区采用CK筛查343 170名男婴，确诊72例DMD，男孩发病率为1∶4 767[11]。本研究对7 035名新生男婴进行筛查，确诊2例DMD，发病率为1∶3 518。

CK一直是DMD诊断的重要指标，这是由于DMD基因变异可引起肌肉发生萎缩或炎症，CK从被破坏的肌肉组织中释放进入血液，使血清CK浓度升高。但CK浓度易受年龄、性别、种族、地域、运动状态、疾病等多种因素的影响，且如何界定CK检测值与DMD之间的关系尚无明确标准[12]。CK-MM是CK在骨骼肌中存在的主要同工酶形式，CK-MM作为骨骼肌损伤的指标比CK更具特异性[13]，且相对于检测血清CK，检测滤纸干血片样本CK-MM的创伤更小、成本更低，且运输方便，适合大规模筛查[5]。本实验室在国内率先通过检测滤纸干血片中的CK-MM开展新生儿DMD筛查。本研究对时间分辨荧光法检测滤纸干血片CK-MM的性能进行验证，结果显示批内CV、批间CV和平均偏移均＜10%，实测值与理论值的r=0.999 9。27例DMD患儿的CK-MM均＞1 000 ng/mL，中位浓度是正常对照组的67倍。ROC曲线分析结果显示，CK-MM诊断DMD的敏感性为100%，特异性为99.99%，提示CK-MM对DMD有很好的诊断价值。

DMD为X连锁遗传，女性多为无症状携带者，但约有10%的女性携带者可有轻度的临床表现，极少数出现类似于男性患儿的严重症状，部分女性成年期出现DMD相关性扩张性心肌病，引起左心室扩张和充血性心力衰竭[14]。本研究中有1例女性DMD杂合子基因确诊患者，CK-MM为1 949.46 ng/mL，因CK浓度升高就诊，就诊时已见步态异常。因本研究未将女性新生儿纳入筛查，所以无女性DMD发病率等数据。此例患儿提示今后应不分性别对所有新生儿开展DMD筛查。

综上所述，以滤纸干血片为样本检测CK-MM能有效筛查出DMD患儿，且检测方法简便，值得在临床推广。