蜂胶中提取的咖啡酸苯乙酯和咖啡酸苄酯抑制食管癌Eca109细胞的功效

刘 会，袁雯雯，李俊雅，玄红专

聊城大学生命科学学院，聊城 252059

蜂胶是蜜蜂采集植物树脂并混入其上颚腺、蜡腺的分泌物加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物[1]。由于植物来源不同，蜂胶的化学成分非常复杂。世界不同地区的蜂胶大致分为七类，分别是：“杨树型”蜂胶、“桦树型”蜂胶、巴西绿胶、红胶、太平洋蜂胶、地中海蜂胶以及“克鲁西属”蜂胶[2]。中国蜂胶属于杨树型蜂胶并且其主要的化学组分是黄酮类及酚酸类。到目前为止，已有600种以上的成分从蜂胶中鉴定出来[3]。现代药理学研究表明，蜂胶具有抑菌[4]、抗炎[5,6]、抗病毒[7]、抗肿瘤[8]、抗氧化[9]及免疫调节[10,11]等功效。

研究表明蜂胶对多种不同肿瘤细胞具有较好的抑制功效[12-14]，特别是蜂胶中短叶松素、咖啡酸苄酯(CABE)、咖啡酸苯乙酯(CAPE)、芹菜素、松属素、白杨素和高良姜素等[15]。食管癌是一种严重的恶性肿瘤，严重威胁人类的身体健康。由于食管癌细胞高度浸润和转移，使得该疾病的治疗和预后效果都较差[16,17]。从天然产物中发掘抑制食管癌的药物也是食管癌治疗的一个重要方向。CAPE和CABE是蜂胶中的两种重要酯类，但它们对食管癌的影响还未见报道。本研究重点研究了CAPE和CABE对食管癌Eca109细胞的抑制功效及作用机理，为蜂胶应用于食管癌的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

中国蜂胶产自山东省(购于蜂农)，主要胶源植物为杨树。主要试剂包括：DMEM培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；胰酶、磺酰罗丹明B(SRB)、Hoechst 33258、活性氧检测荧光探针2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)和线粒体膜电位荧光探针JC-1(美国Sigma公司)；Matrigel胶和Transwell孔板(美国Corning公司)、DAPI染料(美国Genview公司)、抗体Caspase-3、PARP(美国Cell Signaling Technology)、β-actin (美国Santa Cruz Biotechnology)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；其它试剂均为分析纯。

Eca109细胞由本实验室保存。

1.2 试验仪器

Heal Force生物安全柜、Heal Force CO2培养箱(力康生物医疗科技控股有限公司)；TE2000S 倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)；激光扫描共聚焦显微镜(Olympus)；电泳仪和电转仪(Bio-Rad公司)；MK3酶标仪(芬兰雷勃公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 CAPE和CABE的制备方法

CAPE和CABE的制备方法根据参考文献[18,19]。首先将中国蜂胶冷冻，粉碎，用热水浸提，过滤，滤液减压浓缩。然后向浓缩液中加入95%乙醇至乙醇含量为70%左右，静置过夜，取上清液浓缩得浸膏。再用大孔吸附树脂粗分离，再依次用0%、20%、40%、60%、80%、95%乙醇-水溶液为流动相梯度洗脱，分别收集洗脱部分，浓缩，得粗分样品。将粗分样品用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，色谱柱为C18SMB 100柱(400 mm×25.4 mm，10 μm)，流动相为甲醇-水，检测波长为280 nm，根据采集到的色谱图手动收集各个目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩。对于高纯度的馏分，其化学结构经核磁共振、X射线单晶衍射等手段进行鉴定，得到CAPE和CABE。

1.3.2 细胞培养

食管癌Eca109细胞培养在添加10%胎牛血清的DMEM培养基中，孵育条件为：5% CO2、37 ℃、饱和湿度CO2培养箱中。倒置相差显微镜下观察细胞形态。

1.3.3 细胞存活率的测定

将处于对数生长期的细胞按4 000个/孔种植到96孔板，24 h后，除正常组外，处理组细胞分别经CAPE(80 μM)和CABE(80 μM)处理后，弃细胞培养液，用10%三氯乙酸4 ℃固定1 h，然后用SRB染色10 min，晾干，100 mmol/L Tris碱溶解，在492 nm处测吸光值。

细胞存活率=(处理组OD值/对照组OD值)

×100%

1.3.4 DAPI染色

DAPI 染色主要用于观察细胞核的形态，在48 h，所有细胞用300 nM DAPI染液室温孵育5 min，细胞经1×PBS轻轻漂洗2～3次，然后在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞核的形态并拍照。

1.3.5 LDH分析

在48 h收集对照组和处理组细胞培养液，离心。上清液中的LDH含量按照试剂盒的操作进行测定。

1.3.6 细胞浸润实验

取对数生长期的Eca109细胞，消化，调整细胞密度到5×105个/mL，Transwell上室加入200 μL细胞悬液，下室中加入750 μL含20%胎牛血清的DMEM培养液，37 ℃孵育48 h。用湿棉签擦掉上室上面的Matrigel和非侵袭细胞，上室下面用95%酒精室温固定10 min，然后用0.1%结晶紫继续固定染色15 min，高倍镜下计数穿过微孔膜的细胞数。直径上取4个视野，求其平均值。

1.3.7 细胞迁移实验

在24孔板中，当细胞密度达到80%时，用10 μL白枪尖垂直在细胞表面划线，然后用1×PBS轻轻冲洗掉细胞碎片。按照实验分组，细胞分别经CAPE(80 μM)及CABE(80 μM)处理48 h，每12 h在倒置相差显微镜下观察、拍照细胞迁移情况。用Image-Pro Plus软件计算细胞迁移率。

1.3.8 活性氧(ROS)水平的检测

将处于对数生长期的Eca109细胞按4×104个/mL种植到共聚焦小皿中。待细胞长到60%以上，除正常组外，处理组细胞分别经CAPE(80 μM)及CABE(80 μM)处理24 h。弃细胞培养液，用1×PBS清洗1次，加DCFH-DA应用液1 mL，37 ℃孵育30 min。弃DCFH-DA应用液，用1 ×PBS漂洗3次，每次5 min，在激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.3.9 线粒体膜电位检测

将处于对数生长期的Eca109细胞按4×104个/mL种植到共聚焦小皿中。待细胞长到60%以上，除正常组外，处理组细胞分别经CAPE(80 μM)及CABE(80 μM)处理24 h。弃细胞培养液。用1 ×PBS清洗，加JC-1染色液500 μL，37 ℃孵育20 min。弃JC-1染色液，用1×PBS漂洗3次，每次5 min，在激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.3.10 细胞蛋白提取及蛋白质免疫印迹

CAPE(80 μM)及CABE(80 μM)分别处理细胞后收集各组细胞，在RIPA裂解液中冰上裂解30 min，BCA法测定总蛋白浓度。取30～40 μg总蛋白提取物上样，经12%SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，然后加入Caspase 3、PARP和β-actin一抗稀释液(1∶1 000)于4℃冰箱孵育过夜。用1×PBST洗膜三次，每次5 min；再加入二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，1×PBST洗膜三次，每次5 min，然后ECL显色。Quantity One进行蛋白定量分析。

1.4 数据统计

图1 蜂胶中11种组分对Eca109细胞增殖的影响Fig.1 The effects of 11 constituents extracted from propolis on Eca109 cells注：a：咖啡酸；b：阿魏酸；c：异阿魏酸；d：3,4-二甲氧基肉桂酸；e：短叶松素；f：CABE；g：CAPE；h：芹菜素；i：松属素；j：白杨素；k：高良姜素。与空白对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。下同。Note:a:Caffeic acid;b:Ferulic acid;c:Isoferulic acid;d:3,4-dimethoxycinnamic acid;e:Pinobanksin;f:CABE;g:CAPE;h:Apigenin;i:Pinocembrin;j:Chrysin;k:Galangin.Compared with control,*P<0.05;**P<0.01.The same below.

2 结果

2.1 蜂胶中11种组分对Eca109细胞增殖的影响

前期我们从蜂胶中分离出11种组分，分别是咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、3，4-二甲氧基肉桂酸、短叶松素、CABE、CAPE、芹菜素、松属素、白杨素和高良姜素。首先检测了这11种组分对食管癌Eca109细胞增殖的影响。结果见图1。由图1可以看出，咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、3，4-二甲氧基肉桂酸对Eca109细胞的增殖没有显著的影响。CABE和CAPE显著抑制食管癌Eca109细胞的增殖(**P<0.01，*P<0.05)。

2.2 CAPE和CABE抑制Eca109细胞增殖并诱导其凋亡

通过初步筛选可以看出CAPE和CABE显著抑制Eca109细胞增殖，接下来我们详细研究了CAPE和CABE在不同时间和不同浓度条件下对Eca109细胞的影响，结果发现在80 μM时，CAPE和CABE随着时间的延长显著抑制Eca109细胞的增殖，且CAPE的效果优于CABE(图2A)(**P<0.01，*P<0.05)；在20～160 μM时随着浓度的增加CAPE和CABE显著抑制Eca109细胞的增殖，且CAPE效果优于CABE(图2B)(*P<0.05)；通过DAPI染色发现CAPE和CABE(80 μM)显著引起细胞核的断裂和浓缩(图3C)；LDH的检测发现，CAPE(20～80 μM)和CABE(20～160 μM)对LDH的释放没有显著影响，但CAPE在160 μM时，LDH释放显著升高，说明高浓度的CAPE可能引起Eca109细胞的坏死(图2D)。

图2 CAPE和CABE抑制Eca109细胞增殖并诱导其凋亡Fig.2 CAPE and CABE inhibited proliferation and induced apoptosis in Eca 109 cells注：A：80 μM CAPE和CABE处理Eca109细胞0、3、6、12、24和48 h后细胞存活率；B：不同浓度CAPE和CABE处理Eca109 48 h后细胞存活率；C：DAPI染色(200×)；D：CAPE和CABE处理对Eca109细胞中LDH的影响。Note:A:Eca109 cells were treated with 80 μM CAPE and CABE for 0,3,6,12,24 and 48 h;B:Cell viability of Eca109 48 h after treatment with different concentrations of CAPE and CABE;C:DAPI staining (200×);D:Effects of CAPE and CABE treatment on LDH in Eca109 cells.

2.3 CAPE和CABE抑制Eca109细胞迁移和浸润

如图3所示，随着时间的延长，与对照组相比CAPE和CABE(80 μM)显著抑制 Eca-109细胞的迁移和浸润(**P<0.01)，并且CAPE(80 μM)对Eca109的抑制迁移功效要好于CABE。

2.4 CAPE和CABE上调Eca109 细胞中Caspase 3和PARP水平

接下来，我们检测了CAPE和CABE对Eca109细胞中凋亡执行者Caspase 3和PARP水平的影响。结果可以看出，CAPE 和CABE(80 μM)显著上调了Caspase 3和PARP的水平(**P<0.01，*P<0.05)，表明CAPE和CABE诱导Eca109细胞凋亡，而且随着浓度和时间的延长，CAPE和CABE诱导凋亡更显著(图4)。

图3 CAPE和CABE抑制Eca109细胞迁移和浸润Fig.3 CAPE and CABE significantly suppressed the migration and invasion of Eca109 cells注：A：CAPE和CABE对Eca109细胞浸润的影响；B：CAPE和CABE对Eca109细胞迁移的影响；C：CAPE和CABE对细胞迁移影响的量化图。Note:A:Effects of CAPE and CABE on Eca109 cell infiltration;B:Effects of CAPE and CABE on migration of Eca109 cells;C:Quantification of the effects of CAPE and CABE on cell migration.

2.5 CAPE和CABE 抑制Eca109细胞中Procaspase 9和Bcl-2的水平

进一步检测了CAPE和CABE处理Eca109 细胞24 h后对细胞中Caspase 9、Bcl-2和BAX的影响。结果发现，CAPE和CABE显著抑制Bcl-2蛋白的表达和Procaspase 9的水平(**P<0.01，*P<0.05)，而且CAPE的效果要好于CABE。CAPE和CABE对Eca109细胞中Bax的蛋白表达具有抑制趋势。

图4 CAPE和CABE 上调Eca109细胞中Caspase 3和PARP的水平Fig.4 CAPE and CABE obviously upregulated the levels of Caspase 3 and PARP in Eca109 cells注：A和D：Eca109细胞经CAPE和CABE处理后PARP、Procaspase 3、Caspase 3和β-actin蛋白表达；B、C、E、F：PARP、Caspase 3蛋白量化图。Note:A and D:Expression of PARP,Procaspase 3,Caspase 3 and β-actin in Eca109 cells treated with CAPE and CABE;B,C,E and F:Quantification of relative protein expression quantity of PARP,Caspase 3.

图5 CAPE和CABE 抑制Eca109细胞中procaspase 9和Bcl-2的水平Fig.5 CAPE and CABE obviously down-regulated the levels of procaspase 9 and Bcl-2 in Eca109 cells注：A：Eca109细胞经CAPE和CABE处理24 h后procaspase 9、BAX、Bcl-2和β-actin蛋白表达；B,C和D：procaspase 9、BAX和Bcl-2蛋白量化图；E：Bcl-2和BAX的比值。Note:A:Expression of procaspase 9,BAX,Bcl-2 and β-actin in Eca109 cells treated with CAPE and CABE at 24 h.B,C and D:Quantification of relative protein expression quantity of procaspase 9,BAX and Bcl-2;E:The ratio of Bcl-2 to BAX.

2.6 CAPE和CABE上调ROS水平并降低线粒体膜电位

CAPE 和CABE (80 μM) 显著上调Eca109细胞中的ROS水平，同时CAPE和CABE也显著降低细胞内线粒体膜电位水平(图6)。

3 讨论与结论

我们前期研究了蜂胶及其主要组分对人乳腺癌细胞(MCF-7和MDA-MB-231)、肺癌细胞(A549)、宫颈癌细胞(HeLa)、胶质瘤细胞(U87、U172)以及人肝癌细胞的抗肿瘤活性[18-20]。本实验首次研究了蜂胶中11种主要组分对人食管癌细胞Eca109的毒性，发现CAPE和CABE对人食管癌细胞具有较好的抑制的功效，而且在有效的抑制肿瘤细胞增殖的浓度范围内不会引起细胞的坏死，表明蜂胶中的这两种酯类化合物在治疗和预防食管癌方面具有潜在的应用价值。

图6 CAPE和CABE 上调Eca109细胞中ROS水平并降低线粒体膜电位Fig.6 CAPE and CABE obviously increased the levels of ROS and decreased mitochondrial membrane potential level in Eca109 cells注：A：CAPE和CABE对ROS影响及量化图；B和C：CAPE和CABE对线粒体膜电位的影响及量化图。Note:A:Quantification of CAPE and CABE on the levels of ROS;B and C:Effects of CAPE and CABE on mitochondrial membrane potential and quantification diagram.

活性氧(ROS)主要包括超氧阴离子、氢氧自由基和过氧化氢等。高水平的ROS对细胞产生显著的损伤效应，可导致DNA损伤、蛋白质氧化以及脂质功能紊乱，从而引起细胞代谢、功能异常。大量研究表明，ROS可以作为第二信使参与包括凋亡在内的细胞代谢调控，在细胞内信号转导通路中发挥重要作用。而且ROS与癌细胞的异常增殖、转移和侵袭过程密切相关。本研究表明，CAPE和CABE处理引起Eca109细胞中ROS水平显著上调，并且促凋亡蛋白显著上调，抑凋亡蛋白显著下降，同时肿瘤细胞的增殖、迁移和浸润都受到显著抑制。据此，推测CAPE和CABE主要是通过ROS介导的线粒体内源性途径促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖和迁移。

食管癌是常见的消化道肿瘤，是一种食管上皮组织的恶性肿瘤，我国是世界上食管癌高发地区之一。蜂胶是一种重要的天然产物，对多种肿瘤细胞具有抑制功效。本研究进一步证实蜂胶中的CAPE和CABE是两种重要的抑制食管癌细胞增殖的天然产物。相比较于CABE， CAPE的研究非常多，其药理学活性研究的非常深入[20]。CABE的研究相对较少，但通过本实验研究发现，CABE也是一种重要的抑制食管癌细胞增殖、转移、浸润并诱导其凋亡的重要化合物，今后还需要进一步深入研究CABE的药理学活性和作用机理。

总之，尽管CAPE和CABE化学结构非常相似，但其对食管癌Eca109的抑制活性还是有差异，CAPE比CABE显示出更好地促进食管癌细胞凋亡的活性。CAPE和CABE抑制食管癌Eca109细胞增殖主要是通过线粒体介导的内源性途径促进肿瘤细胞凋亡。CAPE和CABE是潜在的治疗食管癌的化合物，值得深入研究。