基于网络药理学与分子对接技术探讨红花治疗视网膜静脉阻塞的作用机制研究

裴 超，邵霖霖，刘 晶，施慧彬，冯 俊

中国中医科学院眼科医院，北京 100040

视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion，RVO)是导致视力下降的主要原因之一，也是仅次于糖尿病性视网膜病变的第二大常见的视网膜血管疾病，主要临床特征为黄斑水肿、视网膜出血、静脉迂曲扩张。依据阻塞位置不同，临床上分为视网膜分支静脉阻塞(branch retinal vein occlusion，BRVO)和视网膜中央静脉阻塞(central retinal vein occlusion，CRVO)两种主要类型，前者更为多见。流行病学研究表明，全球约1 600万人罹患RVO，总体发病率为5.20/1 000，其中BRVO的发病率为4.42/1 000，CRVO的发病率为0.80/1 000；而中国(北京地区)10年RVO发病率为1.9±0.1/100[1,2]。高血压、糖尿病、血脂异常、高同型半胱氨酸血症等被认为是RVO的危险因素。视网膜静脉阻塞的确切发病机制尚不完全清楚，可能是静脉血栓形成的Virchow’s三联征(即血流动力学变化、血管壁退行性变化及血液高凝状态)级联反应的结局[3]。玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)药物和糖皮质激素类药物是RVO的主要治疗手段，但仍存在药效短暂、药物不良反应及病情易反复等问题。

视网膜静脉阻塞归属于中医学“络瘀暴盲”范畴，本病基本病机是脉络瘀阻、血溢络外，治以“剔络化瘀、活血利水”为主。红花是活血祛瘀、通经止痛之要药，是活血化瘀方剂治疗RVO的常用配伍药味。现代药理学研究证实，红花中已分离鉴定化学成分有100多种，包括黄酮类、生物碱、聚炔类及脂肪酸等化合物，具有扩张血管、改善微循环、增加血流量、抗血栓、抗炎、调节免疫等作用[4]。红花注射液由红花经水煮醇沉工艺加工而成，具有活血化瘀之功效，主要用于治疗闭塞性脑血管疾病，冠心病，脉管炎等疾病[5]。临床研究表明，红花注射液治疗RVO能够提高患者的视力，促进眼底出血、渗出的吸收，消退视网膜水肿[6]。红花治疗RVO的物质基础和活血化瘀功效的科学内涵尚未阐明。

网络药理学是系统生物学、药物化学、药理学和生物化学等多学科整合的一门新兴学科。2007年英国学者HopKins教授在网络生物学的基础上提出了“网络药理学”概念，其核心思想是通过对基因、蛋白、代谢物互作网络的多维度、多途径、多靶点整合调节来揭示药物作用机制和指导药物分子设计[7]。网络药理学的研究理念与中药多成分-多靶点-协同调节模式极为契合，为中药单体或复方活性成分与潜在作用靶点提供了新的视角。分子对接技术是利用计算机技术模拟药物化合物与疾病靶标之间的几何结构与空间相互作用，以识别具有治疗意义的化合物。本研究旨在通过网络药理学探讨红花治疗RVO的“多成分-多靶点-多途径”整体调节的作用机制，同时将预测得到的红花活性成分与对应作用靶点进行分子对接初步验证，从而为后续基础研究提供一定的科学理论依据。

1 方法

1.1 红花活性成分和作用靶点的收集

从TCMSP数据库(http://tcmspw.com)中获取红花的活性成分和潜在作用靶点，同时结合文献补充相关化学成分。以“Honghua/红花”为检索词，筛选条件：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且类药性(drug-like，DL)≥0.18。然后通过UniProt数据库(https://www.uniprot.org)，限定物种为“Homo sapiens”，校正所获取活性成分对应靶点基因名。

1.2 RVO相关疾病靶点的收集

通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org)和OMIM数据库(https://omim.org)，以“retinal vein occlusion”为关键词分别进行检索，剔除重复靶点，获取RVO相关疾病唯一靶点基因。

1.3 构建疾病-成分-靶点网络

利用R 3.6.3软件运行R语言获取红花-RVO的交集靶点，通过FunRich 3.1.3软件绘制Venn图，利用Cytoscape 3.7.0软件绘制疾病-成分-靶点网络。

1.4 构建蛋白互作网络(protein-protein interactions，PPI)与筛选核心靶点

将“1.3”获取的红花-RVO的交集靶点导入String 11.0数据库(https://string-db.org)，条件设置：限定物种为“Homo sapiens”，最低置信度得分≥0.700，且隐藏离散的网络节点，得到交集靶点的蛋白互作数据信息。利用Cytoscape 3.7.0软件的network analyzer功能构建PPI网络图和筛选关键靶点。

1.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

将1.3获取的红花-RVO交集靶点导入Metascape数据库(https://metascape.org)进行GO功能富集分析(包括生物过程(biological process，BP)、细胞成分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF))和KEGG通路富集分析，然后依据P<0.05选取排名前10的GO富集分析和排名前15的KEGG通路富集分析结果，利用GraphPad Prism 5.0软件绘制柱状图。

1.6 红花活性成分和作用靶点的分子对接验证

选取疾病-成分-靶点网络中degree值排名靠前的红花活性成分和PPI网络中degree值排名靠前的靶点基因进行分子对接。从TCMSP数据库获取红花化学成分的分子结构mol2格式；从RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org)获取对应靶点基因的3D分子结构pdb格式。红花主要活性成分和关键靶点基因的分子结构文档均使用AutoDock Tools 1.5.6软件转换为pdbqt格式，利用AutoDock Vina 1.1.2软件进行分子对接。通过Pymol 2.3.2软件将对接得分较高且构象较稳定的化合物与靶点蛋白进行分子对接可视化分析。

2 结果

2.1 红花活性成分和作用靶点的收集

通过TCMSP数据库共收集到符合标准的红花活性成分22个和对应的潜在作用靶点数目367个，利用UniProt数据库校正靶点基因名，去除无效及重复值，共得到186个作用靶点。

2.2 RVO相关疾病靶点的收集

通过GeneCards数据库和OMIM数据库分别获取RVO疾病靶点数目1 704个，148个；合并且剔除重复值后共得到1 842个。

2.3 构建疾病-成分-靶点网络

将TCMSP数据库收集的红花潜在作用靶点186个和GeneCards数据库与OMIM数据库获取的RVO疾病靶点1 842个，运用R 3.6.3软件运行R语言得到红花-RVO交集靶点数目128个，同时利用FunRich 3.1.3软件绘制Venn图(图1)。

图1 药物-疾病交集靶点Venn图Fig.1 Venn diagram of drug-disease intersection targets

将上述所得红花活性成分与红花-RVO交集靶点导入Cytoscape 3.7.0软件绘制疾病-成分-靶点网络(图2)，网络包含145个节点(1种疾病名，1个中药名，15种中药活性成分，128个靶点)和404条边，每条边表示疾病-药物所对应靶点、药物所对应化学成分以及药物化学成分与潜在作用靶点的相互作用关系。其中槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、黄芩素(baicalein)、β-谷甾醇(beta-Sitosterol)、β-胡萝卜素(beta-carotene)这6种活性成分所对应的靶点数目从高到低依次是102、39、35、20、20、16，说明它们可能是红花的关键活性成分(表1)。

图2 疾病-成分-靶点网络Fig.2 Disease-component-target network

表1 红花15种活性成分信息及对应靶点数目Table 1 Information of 15 active ingredients of Carthami Flos and number of corresponding targets

图3 红花-RVO交集靶点PPI网络Fig.3 Carthami Flos-RVO intersection target PPI network

2.4 PPI网络构建与分析

将“1.3”得到的128个红花-RVO交集靶点导入String 11.0数据库获取蛋白互作数据信息，然后利用Cytoscape 3.7.0软件构建PPI网络(图3)。PPI网络分析结果，PPI网络(富集P值<1.0e×10-16)包含128个节点，986条边，节点的平均度值(degree)为15.4。节点(node)表示蛋白，边(edge)表示蛋白之间的相互作用关系；度值大小决定节点面积大小，节点面积越大表示蛋白在网络中所起的作用越大；节点颜色深浅代表节点相互作用程度大小，节点颜色由内向外颜色越浅代表蛋白之间相互作用程度越低。依据节点度值大小，AKT1(58)、IL6(53)、JUN(51)、MAPK1(51)、MAPK8(50)、VEGFA(48)、EGF(42)、CXCL8(41)、MMP9(40)这9个靶点蛋白可能在网络中起着关键作用。

2.5 GO与KEGG富集分析

将128个红花-RVO交集靶点导入Metascape数据库分别进行GO和KEGG富集分析(限定物种：Homo sapiens；P<0.05)，共得到GO富集条目2 282个，其中生物过程条目2 000个，主要涉及脂多糖反应、细胞因子介导的信号途径、细胞外刺激反应、有机环状化合物的细胞反应、凋亡信号途径及细胞增殖负性调控等；分子功能条目174个，主要涉及转录因子结合、细胞因子受体结合、蛋白同源二聚体活性、蛋白激酶结合、类固醇激素受体活性等；细胞成分条目108个，主要涉及膜筏、囊腔、细胞外基质、RNA聚合酶II转录因子复合物、胞质核周区等。共得到167个KEGG富集条目，主要涉及癌症相关通路、糖尿病并发症相关AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路、VEGF信号通路及p53信号通路等。依据P值筛选排名前10的GO富集分析和排名前15的KEGG富集分析，利用GraphPad Prism 5.0软件绘制柱状图(图4、图5)。

图4 红花-RVO交集靶点GO富集分析柱状图Fig.4 Histogram of GO enrichment analysis of Carthami Flos-RVO intersection targets

图5 红花-RVO交集靶点KEGG富集分析柱状图Fig.5 Histogram of KEGG enrichment analysis of Carthami Flos-RVO intersection targets

2.6 红花主要活性成分与对应靶点蛋白的分子对接验证

运用AutoDock Vina 1.1.2软件将槲皮素、木犀草素、山柰酚等化合物与AKT1、IL6、JUN、MAPK1、VEGFA等对应靶点分别进行分子对接。一般认为，结合能(Binding energy，kcal/mol)小于-4.25 kcal/mol表示配体小分子与受体蛋白之间有一定的结合活性；结合能小于-5.0 kcal/mol表明配体小分子与受体蛋白之间有较好的结合活性；结合能小于-7.0 kcal/mol表明配体小分子与受体蛋白具有强烈的结合活性。结合能反应受体与配体之间结合的可能性，结合能越低表示受体与配体亲和力越高，构象越稳定，说明两个分子在自然状态下结合释放能量越低即更容易结合。分子对接结果提示，槲皮素、木犀草素、山柰酚、黄芩素、β-胡萝卜素、β-谷甾醇等6种化合物与AKT1、IL6、CXCL8、VEGFA、MAPK1、MAPK8、JUN、MMP9、EGF等9种对应靶点的结合能均小于-5.0 kcal/mol，说明两者间均有着较好的结合活性。选取槲皮素与IL6(PDB ID:4cni)、槲皮素与VEGFA(PDB ID:3v2a)、木犀草素与MMP9(PDB ID:1l6j)、木犀草素与MAPK1(PDB ID:4iz5)，借助Pymol 2.3.2软件分别进行分子对接可视化分析(图6)。分子对接虚拟技术发现，化合物均稳定地位于口袋状的对接口袋内。槲皮素与活性位点附近的Gln-152、Arg-104、Gln-156、Asp-160这4个氨基酸形成氢键结合到IL-6；槲皮素与活性位点附近的Asn-62这1个氨基酸形成氢键结合到VEGFA；木犀草素与活性位点附近的Thr-426、Arg-424、Pro-415这3个氨基酸形成氢键结合到MMP9；木犀草素与活性位点附近的Lys-54、Ser-153、Met-108、Lys-114这4个氨基酸形成氢键结合到MAPK1。

表2 红花主要活性成分与对应作用靶点的分子对接Table 2 Molecular docking of main active in gredients of Carthami Flos and corresponding targets

图6 分子对接模式图Fig.6 Pattern diagram of molecular docking注：A.槲皮素-IL6(PDB ID:4cni)；B.槲皮素-VEGFA(PDB ID:3v2a)；C.木犀草素-MMP9(PDB ID:1l6j)；D.木犀草素-MAPK1(PDB ID:4iz5)。Note:A.Quercetin-IL6 (PDB ID:4cni);B.Quercetin-VEGFA (PDB ID:3v2a);C.Luteolin-MMP9 (PDB ID:1l6j);D.Luteolin-MAPK1 (PDB ID:4iz5).

3 讨论

红花是菊科植物红花的干燥花，辛，温，归心、肝经，具有活血通经，祛瘀止痛之功效。《本草汇言》曰：“红花，破血、行血、和血、调血之药也。”说明红花是活血化瘀之佳品。本研究通过网络药理学筛选得到红花15种活性成分，其中槲皮素、木犀草素、山柰酚、黄芩素、β-胡萝卜素、β-谷甾醇等6种化合物可能是治疗RVO的物质基础，具有抗炎、抗氧化、调节免疫等生物活性。药理学研究表明，槲皮素对H2O2诱导血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)氧化应激损伤起到修复作用，可能通过激活PI3K/Akt信号通路减轻氧化应激对受损血管的影响，促进血管EPCs增殖和分化[8]。木犀草素具有扩张血管和保护血管的双重生物活性，可以有效保护血管内皮免受氧化应激损伤[9]。山柰酚能够抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞的炎症反应，说明山柰酚对炎症状态下的血管内皮具有保护作用[10]。β-胡萝卜素对高糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞损伤具有保护作用，可能与抗脂质过氧化作用、诱导NO的生成及促进活性氧的降解有关[11]。

通过疾病-成分-靶点网络和PPI网络分析表明，IL6、CXCL8、VEGFA、MMP9、MAPK1、AKT1等可能是红花治疗视网膜静脉阻塞的关键靶点。全身或局部炎症反应可能是RVO的重要发病机制。IL6是一种重要的促炎细胞因子，通过肌动蛋白微丝重排促进相邻细胞间缝隙连接的形成，从而增加血管内皮通透性[12]。VEGFA是一种强效、可扩散的内皮特异性有丝分裂原，在缺氧条件下释放，与血管内皮表达的VEGF受体结合后，可引起视网膜血管内皮细胞紧密连接的构象变化而导致血管通透性增高[13]。临床研究证实，RVO患者房水中的IL6和VEGF表达水平明显高于对照组，说明IL6通过诱导VEGF表达上调增加血管通透性，同时也会加重视网膜缺血[14]。CXCL8(即IL8)是参与炎症细胞募集的趋化细胞因子。伴有黄斑水肿的BRVO患者的玻璃体液内IL8的表达水平明显高于对照组，提示IL8可能会增加血管通透性和黄斑水肿[15]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一种钙或锌依赖性细胞外蛋白水解酶，在各种生理和病理条件下，在降解和重塑细胞外基质中发挥重要作用，尤其是MMP9与多种内皮细胞功能有关，包括增殖、分化和迁移等[16]。RVO患者房水中MMP9的浓度明显高于白内障对照组，且与视功能损害呈负相关[17]。

GO富集分析结果表明，红花治疗RVO可能通过调控脂多糖反应、细胞因子介导的信号途径、细胞外刺激反应、凋亡信号途径及细胞增殖负性调控等生物过程，发挥着抗炎、调节免疫、抑制细胞凋亡等作用。KEGG富集分析结果表明，PPI网络的关键靶点主要富集于糖尿病并发症相关AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路、VEGF信号通路、IL-17信号通路及p53信号通路等炎症、氧化应激、细胞凋亡等信号途径。VEGF过度表达导致白细胞淤滞，视网膜血管闭塞及视网膜缺血，同时也可激活NF-κB信号通路，调控下游靶点基因血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)的表达[18]。Long等[19]通过光化学法成功构建实验性BRVO模型，吸入氢气可减轻视网膜水肿，缩短血管再灌注时间，改善视网膜功能，证实了吸入氢气可能激活VEGF信号通路，从而下调VEGFA的表达。IL-17主要由辅助性T细胞产生，IL-17信号通路通过调控IL-6、IL-8、ICAM-1、VEGF的表达，从而促进人视网膜血管内皮细胞的增殖和迁移，诱使毛细血管管腔形成[20]。因此，推测红花通过NF-κB信号通路、VEGF信号通路、IL-17信号通路等信号通路调控IL-6、IL8、VEGFA等关键靶点治疗RVO。分子对接结果提示，槲皮素、木犀草素、黄芩素、山柰酚等化合物与IL6、IL8、VEGFA、MMP9、MAPK1等对应靶点结合能均小于-5.0 kcal/mol，提示两者有着良好的结合活性，说明它们可能是治疗RVO的潜在活性成分。

综上所述，通过网络药理学和分子对接验证提示，红花通过“多成分-多靶点-多途径”协同作用治疗RVO，发挥抑制炎性反应、抗氧化、调节免疫等作用。鉴于网络药理学的局限性，后续基础研究可以围绕预测得到的化合物、作用靶点及信号通路作进一步实验验证，为中医药治疗RVO提供可靠的科学内涵。