枸杞芽叶有效成分对急性酒精性肝损伤保护作用研究

栾 倩，樊 毅，张 淼，张元强，许露露，哈成勇*，张玉彬*

1 中国药科大学生命科学与技术学院，南京 211198；2 银川中科元昊科技有限公司，银川 750000；3 江苏省人民医院浦口分院，南京 211800

我国是肝病大国，随着新生儿乙肝疫苗的广泛使用，病毒性肝病正在逐年减少，但随着人们生活方式的改变，非病毒性肝病正在逐年增加。非病毒性肝病主要包括酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)、酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪肝、非酒精性肝病、药源性肝病、肝硬化和肝癌等[1]，严重影响着人类的健康。ALD是非病毒性肝病的主要代表，也是其他肝病的重要诱因，其发病率逐年增加，并趋向于年轻化发展。ALD初期是长期大量饮酒导致的肝脏病变，其发病机制复杂且研究不够透彻。目前对于ALD的治疗缺少有效药物，迫切需要研发新的治疗药物[2,3]。

《本草纲目》记载“春采枸杞叶，名天精草”。天精草具有养肝明目、补虚益精之功效。枸杞是传统中药，具有护肝明目作用。多年来，人们对枸杞果实的研究较多[4]，但对枸杞叶有效成分用于治疗ALD的研究报道相对较少。本论文以枸杞芽叶为原料，从中分离纯化制备得到枸杞芽叶有效成分(AILBL)，研究发现其有效成分主要含有一组以黄酮类物质主要成分的抗氧化性物质[5]。ALD发病机制复杂，现代病理学研究发现“二次打击”学说即氧化应激和炎症性反应，其中氧化应激是ALD发生与发展的关键因素[6]，因此，含有抗氧化性活性成分的枸杞叶有效成分是开发临床治疗ALD的天然药物资源。本研究旨在探索枸杞芽叶有效成分对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用及可能的抗氧化作用机制，为后期开发具有防治酒精性肝损伤的功能性食品添加剂或保健品提供理论基础。

1 实验材料

1.1 实验动物与细胞

8周龄雄性ICR小鼠，购于扬州大学比较医学中心(合格证号：NO.201928893，许可证号：SYXK (苏)2018-0019)，体重20±2 g，于12小时昼夜交替、通风、恒温(25 ± 2 ℃)、恒湿(50%～60%)的动物房内饲养，自由饮水，饲以标准实验动物饲料(购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场)。所有动物实验均按江苏省和中国药科大学实验动物管理与操作要求进行。

人肝癌HepG2细胞购于美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)，用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，并加入100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2 药品与试剂

枸杞芽叶由宁夏杞芽食品科技有限公司提供，并经中国药科大学生药学张勉教授鉴定；无水乙醇和石油醚(上海Titanic科技有限公司)；大孔树脂HP-20(上海摩速科学器材有限公司)；DPPH(上海源叶生物科技有限公司)；ABTS法检测总抗氧化能力试剂盒、ALT和AST检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白定量试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)；DCFH-DA、DAPI(Sigma)；增强型ECL化学发光检测试剂盒(上海翊圣生物科技有限)；抗CYP2E1抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司)；抗GAPDH抗体和辣根过氧化物酶标记的IgG二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)。

1.3 实验仪器

高速多功能粉碎机(永康市鑫之鸿电器有限公司)；AF-1型电热恒温鼓风干燥箱(江苏东台电器厂)；磁力搅拌水浴锅HCJ-4E(常州朗越仪器制造有限公司)；电热恒温水浴锅(太仓精宏仪器设备有限公司)；R-201旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；分析天平BS 124S(天津市天马仪器厂)；电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；752 UV/Vis紫外-可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；冷冻干燥机(无锡市金利大纸塑制品有限公司)；酶标仪(美国BioRad)；TGL-20M高速冷冻离心机(湖南湘仪实验仪器开发公司)；CO2细胞培养箱(赛默飞世尔科技)；生物安全柜(赛默飞世尔科技)；电泳槽(上海天能科技有限公司)；凝胶成像分析系统(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 枸杞芽叶粗提液(crude AILBL)的制备[5]

将枸杞芽叶用高速多功能粉碎机进行粉碎，采用乙醇回流提取，提取条件为：乙醇浓度78%，提取时间2.5 h，提取温度75 °C、料液比1∶30，过滤得上清液，将液体静置于4 °C冰箱12 h后，再过滤，将上清液减压浓缩至无醇味，再将得到的浓缩液用石油醚萃取脱色，最后将水溶相减压浓缩至无石油醚味，即得枸杞芽叶粗提液(crude AILBL)。

2.2 枸杞芽叶有效成分(AILBL)的制备[5]

将“2.1”中所得的枸杞芽叶粗提液用HP-20大孔树脂进行纯化，纯化条件为：上样浓度为9.056 mg/mL，上样流速为2.0 mL/min，上样体积为8 BV，60%乙醇溶液为洗脱液，洗脱流速为3 mL/min，洗脱剂用量为3 BV。将纯化得到的得液体减压浓缩、冻干，即得枸杞芽叶有效成分(AILBL)。

2.3 ABTS法检测总抗氧化能力

采用ABTS法，以Trolox溶液、芦丁溶液为参考标准，体外检测AILBL的抗氧化活性。取一块96孔板，分别设定空白孔、对照孔、Trolox标准检测孔、芦丁标准检测孔和样品检测孔。按照ABTS试剂盒的操作方法，取10 μL不同浓度的Trolox溶液、芦丁溶液和AILBL样品溶液于96孔板，以10 μL蒸馏水为空白，最后每孔分别加入20 μL的ABTS应用液和170 μL的ABTS工作液，混匀，室温反应6 min，用酶标仪于波长405 nm下检测各孔吸光度值。ABTS+·清除能力的计算公式如下。

ABTS+·清除能力= [1-(OD检测-OD对照)/

OD空白]×100%

式中OD检测为不同浓度的Trolox溶液、芦丁溶液及样品溶液测定的吸光值；OD对照为蒸馏水代替ABTS工作液加入测得的吸光值；OD空白为水代替样品溶液测得的吸光值。

2.4 DPPH法检测AILBL总抗氧化能力

采用DPPH法[7]，以Trolox溶液、芦丁溶液为参考标准，体外检测AILBL的抗氧化活性。精密配置1 mM浓度的DPPH溶液作为储备液，实验前将DPPH储备液稀释10倍至0.1 mM，得到DPPH工作液；取100 μL蒸馏水于空白孔中，取100 μL不同浓度的Trolox溶液和芦丁溶液于阳性对照孔中，取100 μL不同浓度的AILBL样品溶液于检测孔中，最后加入DPPH工作液100 μL，混匀，室温避光反应20 min，酶标仪测量各孔在波长517 nm处的吸光度值。DPPH·清除能力的计算公式如下。

DPPH·清除能力=[1-(OD检测-OD对照)/OD空白]

×100%

式中OD检测为不同浓度的Trolox溶液、芦丁溶液及样品溶液测定的吸光值，OD对照为蒸馏水代替DPPH工作液加入测得的吸光值，OD空白为水代替样品溶液测得的吸光值。

2.5 动物分组、模型建立及给药

取雄性ICR小鼠48只，体重20±2 g，适应环境3天后，随机分为6组，每组8只，分别为正常对照组、酒精模型组(6 g/kg，i.g.)、阳性药对照组水飞蓟素(silymarin)(200 mg/kg，i.g.)、AILBL低、中、高剂量组(30、100、300 mg/kg，i.g.)。各给药组灌胃给药每天1次，连续1周，给药体积为15 mL/kg，对照组和模型组灌胃给予相同体积赋形剂。除正常对照组外，其余各组小鼠于末次给药结束后12 h，给予小鼠灌胃6 g/kg的酒精，间隔12 h灌胃一次，共3次。

2.6 小鼠肝脏H&E染色和血清生化指标测定

末次灌胃酒精6 h后处理小鼠，眼眶取血，静置30 min，6 000 rpm离心10 min，常规分离血清。脱颈椎处死小鼠，迅速取出肝组织称重，并在左肝叶同一部位，同时取小块肝组织以10%福尔马林溶液固定，送至武汉塞维尔生物有限公司做常规石蜡包埋、切片以及H&E染色，观察肝组织病理改变。定量称取肝组织置于0.9%生理盐水中匀浆，制备10%肝脏匀浆液，离心后收集上清。按试剂盒说明书要求，用酶标仪法分别测定血清中ALT、AST、肝组织中MDA和GSH含量。

2.7 免疫组化检测氧化应激相关蛋白

将制备完成的切片按照脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化氢酶、血清封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色、脱水、封片的标准步骤进行免疫组化染色，通过软件分析阳性反应物相对含量，检测氧化应急相关蛋白CYP2E1、HIF-1α、iNOS的变化。

2.8 体外ROS测定

取对数生长期的HepG2细胞2×105个/孔接种于6孔板中。次日，待细胞融合度达到70%时，给药组用2 mL含不同浓度AILBL(0、20、40 μg/mL)的培养基预孵育6 h，空白对照组和乙醇模型组加入含等体积的空白溶剂的培养基，然后模型组和给药组加入46.7 μL无菌乙醇(终浓度400 mM)，空白组加入等体积的无菌水，处理24 h。弃上清，PBS洗三次，加入DCFH-DA探针工作液，37 ℃避光温育30 min后，PBS再洗两次。加入DAPI探针工作液，37 ℃避光温育15 min后，PBS洗三次后，10%多聚甲醛避光固定10 min，荧光显微镜下观察情况，并拍照。

2.9 Westerm blot检测CYP2E1表达

取对数生长期的HepG2细胞2×105个/孔接种于6孔板中。次日，待细胞融合度达到70%时，给药组用2 mL含不同浓度AILBL(0、20、40 μg/mL)的培养基预孵育6 h，空白对照组和乙醇模型组加入含等体积的空白溶剂的培养基，然后模型组和给药组加入46.7 μL无菌乙醇(终浓度400 mM)，空白组加入等体积的无菌水，处理24 h。收集细胞，用冰冷的RIPA裂解液进行细胞裂解，超声裂解后于4 ℃、12 000 g下离心20 min，吸取上清以BCA法测定蛋白浓度。蛋白上样量为20 μg，进行SDS-PAGE电泳，随后通过电转将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭膜。一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h。最后，用ECL化学发光底物进行发光显影，用Image J软件对所得图像进行蛋白质条带的半定量分析。

2.10 统计学处理

本文均采用GraphPad Prism5.01软件对所得实验数据进行统计分析，多组之间的数据应用One-way ANOVA对其进行检测，P<0.05表示有统计学意义；P<0.01表示有显著性差异；P<0.001表示有极显著差异。

3 结果

3.1 AILBL的体外抗氧化能力

经化学法和HPLC及LC-MS分析检测表明本实验研究所用枸杞叶有效成分AILBL是一组以黄酮类化合物为主要成分的天然抗氧化物[5]。采用ABTS法检测总抗氧化的结果如图1所示，随着样品浓度的增加，样品对ABTS+·的清除率不断增加，最后趋于平缓。经HP-20大孔树脂纯化后的枸杞芽叶有效成分(AILBL)清除ABTS+·的能力显著高于枸杞芽叶有效成分粗提液(Crude AILBL)(P<0.001)，在1 mg/mL时。通过GraphPad Prism软件计算可知Trolox和AILBL的ABTS+·半数清除浓度EC50分别是0.5679和0.6554mg/mL，AILBL粗提液和芦丁的ABTS+·半数清除浓度EC50均大于2 mg/mL，由此可知四种物质清除ABTS+·的能力顺序为：Trolox>AILBL > AILBL粗提液>芦丁。

图1 不同浓度样品对ABTS+·清除能力Fig.1 ABTS+· scavenging ability in different concentrations of samples

DPPH法检测总抗氧化的结果如图2所示，经HP-20大孔树脂纯化后的AILBL清除DPPH·能力显著高于AILBL粗提液(P<0.001)。随着样品浓度的增加，样品对DPPH·清除率不断增加，最后趋于平缓。通过GraphPad Prism软件计算可知纯化后的AILBL、AILBL粗提液、Trolox以及芦丁的DPPH·半数清除浓度EC50分别是0.236 6、0.870 8、0.715 4、0.455 2 mg/mL，由此可知四种物质清除DPPH·的能力顺序为：AILBL >芦丁>Trolox >AILBL粗提液。

3.2 AILBL对急性酒精性损伤肝功能的保护作用

与正常对照组相比，酒精模型组小鼠血清中ALT和AST活性极显著增加(P<0.001)。与酒精模型组相比，阳性药对照组和AILBL给药组均能不同程度地降低小鼠血清中ALT和AST活性，差异具有统计学意义，且AILBL效果呈现剂量依赖性降低，其中AILBL高剂量组降低效果最为明显(P<0.001)，ALT和AST分别降低了35.08%和27.98%(如表1所示)。可见，AILBL通过降低急性酒精性肝损伤引起的小鼠血清中ALT和AST活性增加进而起到保护肝功能的作用。

图2 不同浓度样品对DPPH·清除能力Fig.2 DPPH· scavenging ability in different concentrations of samples

表1 AILBL对酒精性肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响Table 1 Effects of AILBL on serum ALT and AST in mice with alcoholic liver injury

3.3 AILBL对酒精性肝损伤小鼠氧化损伤的保护作用

与正常对照组相比，酒精模型组小鼠肝脏MDA含量升高2.42倍、GSH含量降低了48.17%(P<0.001)。与酒精模型组相比，阳性药对照组和AILBL给药组均能不同程度地降低小鼠肝脏MDA含量和升高小鼠肝脏中GSH含量，且AILBL效果呈现剂量依赖性，差异具有统计学意义(如表2所示)。由此可见，AILBL能显著降低酒精性肝损伤小鼠的MDA水平，促进GSH再生，增强肝脏自由基的清除能力，从而减少由于体内过氧化产物堆积造成对肝脏的“二次打击”损伤，保护肝脏的功能[8]。

表2 AILBL对酒精性肝损伤小鼠肝脏MDA和GSH含量的影响Table 2 Effects of AILBL on hepatic MDA and GSH in mice with alcoholic

3.4 AILBL对酒精性肝损伤小鼠肝组织病理学的影响

如图3所示，正常对照组(图3A)小鼠的肝细胞形态结构完整，肝细胞未发生脂肪变性。酒精模型组(图3B)肝形态细胞结构不完整，细胞间排列紊乱，细胞间的界限模糊不清，肝细胞肿大，细胞与细胞之间的间隙变大，胞浆呈空泡状，脂滴累积增多，发生明显的气球样脂肪变性。阳性药对照组(图3C)、AILBL低剂量组(图3D)、AILBL中剂量组(图3E)和AILBL高剂量组(图3F)均能不同程度地减少胞浆内的空泡与脂滴，气球样脂肪变性得到缓解。其中AILBL高剂量组恢复效果最为明显，几乎恢复至正常对照组水平。以上结果提示，AILBL可以有效减轻乙醇诱导产生的小鼠肝脏脂肪病变。

图3 AILBL对酒精性肝损伤小鼠肝组织形态结构的影响(×400)Fig.3 Effect of AILBL on hepatic morphology in mice with alcoholic liver injury (×400)注：A：正常对照组；B：酒精模型组；C：阳性药对照组；D：AILBL低剂量组；E：AILBL中剂量组；F：AILBL高剂量组；红色箭头：细胞核固缩；黑色箭头：脂肪空泡。Note:A:Control;B:Ethanol;C:Silymarin;D:L-AILBL;E:M-AILBL;F:H-AILBL;Red arrow:Nuclear pyknosis;Black arrow:Fat vacuole.

图4 AILBL对酒精性肝损伤中氧化应激相关蛋白的影响(×200)Fig.4 Effect of AILBL on oxidative stress-related proteins in alcoholic liver injury (×200)注：A：正常对照组；B：酒精模型组；C：阳性药对照组；D：AILBL低剂量组；E：AILBL中剂量组；F：AILBL高剂量组。Note:A:Control;B:Ethanol;C:Silymarin;D:L-AILBL;E:M-AILBL;F:H-AILBL.

3.5 AILBL动物水平的分子机制

氧化应激是酒精性肝病发生的重要因素之一，CYP2E1作为一种重要的肝代谢酶，能诱发过量ROS的产生，促进氧化应激的出现。图4表明，酒精刺激后，肝脏中CYP2E1表达明显增多，而阳性药水飞蓟素和AILBL给药组均能不同程度抑制酒精诱发的CYP2E1升高。AILBL给药组中高剂量300 mg/kg的效果最好，显著的降低CYP2E1的表达。同时，AILBL能抑制氧化应激相关的缺氧蛋白HIF-1α和iNOS的蛋白表达。

3.6 细胞水平的分子机制研究

如图5所示，与正常对照组相比，400 mM乙醇刺激HepG2细胞24 h后，ROS明显升高，而AILBL(20、40 μg/mL)预给药6 h能显著减少ROS的累积，这表明AILBL能有效缓解乙醇刺激引起的氧化应激。同时，AILBL(20、40 μg/mL)预防给药能明显抑制乙醇刺激诱发的CYP2E1高表达(图6)。由此可见，AILBL能通过抑制CYP2E1的表达和ROS的累积来减少氧化应激的发生，从而保护乙醇诱导的肝细胞损伤。

图5 AILBL减少乙醇刺激HepG2细胞产生的过多ROS(×200)Fig.5 AILBL reduced the excessive production of ROS stimulated by ethanol in HepG2 cell (×200)注：A：正常对照组；B：酒精模型组；C：AILBL低剂量组-20；D：AILBL高剂量组-40。Note:A:Control;B:Ethanol;C:L-AILBL-20;D:H-AILBL-40.

图6 AILBL降低乙醇刺激诱发的CYP2E1升高Fig.6 AILBL decreased the over expression of CYP2E1 induced by ethanol

4 讨论

枸杞是中华传统经典中药之一，在诗经、神农本草经、药性论中经常出现。研究表明，枸杞具有润肺、益气、护肝明目等多种药学功效[5,9,10]。人们较多的研究侧重于枸杞子，而对枸杞芽叶的研究相对较少。枸杞子富含枸杞多糖和黄酮类等抗氧化物质，能增强机体的学习记忆能力、抗疲劳能力和免疫力，并能有效清除机体自由基、提高细胞内抗氧化酶活力，保护肝、肾等脏器，从生理生化学等方面对机体起到保护作用[4]。相对于枸杞子，我们的研究发现枸杞叶中的黄酮类化合物含量比枸杞子更高[5]，在体外具有显著的清除自由基的能力，对ALD实验动物模型具有很好的防治作用，未来可研制为药品或保健品，用于ALD的防治。

大约有20%的人在过量或长期饮酒后出现肝损伤，酒精代谢过程中活性氧自由基生成过剩和脂质代谢紊乱是诱发细胞损伤与凋亡的重要因素。当肝脏细胞及线粒体遭遇活性氧自由基攻击时，细胞内GSH等还原性大分子蛋白质急剧减少、DNA断裂、线粒体及细胞膜破损[2,8]，细胞中ALT和AST释放进入血液，因此常用血清ALT和AST含量评价肝脏损伤和肝功能是否正常。本实验通过连续三次酒精灌胃建立急性酒精性肝损伤模型[3]，本研究发现单独给予酒精灌胃的模型组小鼠血清ALT和AST均超出正常水平，而给予阳性药和不同浓度AILBL预防治疗组小鼠血清中ALT和AST显著下降，且给药组小鼠肝脏组织病理学形态得到良好改善，减少了氧化应激关键蛋白CYP2E1的表达，表明AILBL对急性酒精性肝损伤具有很好的保护作用。

AILBL中富含黄酮等多种抗氧化物质[12]，是其发挥抗氧化、保护细胞氧化损伤的重要物质基础[5,13,14]。本研究发现，AILBL能显著降低急性酒精性肝损伤小鼠的MDA水平，促进GSH再生，增强肝脏自由基的清除能力，从而减少由于体内过氧化产物堆积造成对肝脏的“二次打击”损伤，具有显著的护肝功能。与此同时，AILBL在体外通过抑制CYP2E1表达显著减少乙醇诱导的ROS累积。

综上所述，本实验室通过提取枸杞芽叶中的有效成分并研究其对急性酒精性肝损伤的保护作用发现，AILBL能够通清除肝细胞中MDA，提高GSH水平，抑制肝细胞中CYP2E1的表达，改善酒精引起的肝脏细胞氧化应激、脂质过氧化和炎症，从而达到护肝的功效。本研究将会使枸杞叶有效成分成为预防治疗ALD等肝病的有效药物或保健品，为我国中药现代化研究做出新贡献。