添加柠檬酸钠与次黄嘌呤的腺苷发酵工艺研究

陈华强

(广东肇庆星湖生物科技股份有限公司,广东 肇庆 516100)

腺苷(Adenosine)是人体细胞的一种内源性嘌呤核苷。在生理生化过程中起着重要的调控作用,在神经传递中起重要作用[1-2];也是合成腺嘌呤、三磷酸腺苷(ATP)和阿糖腺苷的重要中间体,在医药和食品领域有广泛的应用。有研究表明:枯草芽孢杆菌添加柠檬酸钠,可降低糖耗速度,明显降低丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的酶活,减少了糖酵解途径的通量,增加了HMP途径的通量[3-4],提高了腺苷的产量。另外,由微生物的补救途径[5]推测,次黄嘌呤作为腺苷合成前体物,在发酵过程添加次黄嘌呤可提高腺苷生产得率。笔者研究发酵培养基中柠檬酸钠和次黄嘌呤的添加量及添加方式对其生产腺苷的影响,通过工艺优化,提高了腺苷发酵水平。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌 种

AR090(Bacillussubtilis,组氨酸和黄嘌呤缺陷)广东肇庆星湖生物科技股份有限公司腺苷生产菌株。

1.1.2 培 养 基

斜面培养基:牛肉膏10 g/L,酵母膏5 g/L,蛋白胨4 g/L,NaCl 2.5 g/L,琼脂25 g/L,pH 7～7.2,0.1 MPa,灭菌20 min。

种子培养基:葡萄糖20 g/L,酵母浸膏20 g/L,KH2PO43 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,MnSO4·7H2O 0.01 g/L,MgSO4·7H2O 0.3 g/L,(NH4)2SO45 g/L,黄嘌呤0.03 g/L,0.1 MPa,灭菌20 min。

摇瓶培养基:葡萄糖80 g/L,(NH4)2SO415 g/L,MgSO4·7H2O 0.6 g/L,KH2PO41.2 g/L,玉米浆膏100 g/L,酵母浸粉30 g/L,黄嘌呤0.05 g/L,pH 7～7.2,0.1 MPa,灭菌20 min。

初始发酵培养基:葡萄糖140 g/L,(NH4)2SO45 g/L,MgSO4·7H2O 0.6 g/L,KH2PO41.2 g/L,玉米浆膏120 g/L,酵母浸粉50 g/L,黄嘌呤0.05 g/L,pH 7～7.2,0.1 MPa,灭菌20 min。

1.1.3 仪器和设备

5 L自控发酵罐,上海保兴生物设备有限公司,配备pH和DO电极各1支;722N型分光光度计:上海精密科学仪器有限公司;SBA-40E生物传感分析仪,山东省科学院生物研究所;Agilent 1200高效液相色谱仪,美国Agilent公司。

1.2 培养方法

菌种培养:取甘油种划线于斜面培养基,32 ℃条件下恒温培养12 h,待用。

种子液的制备:将斜面种用无菌水洗脱,接种于5 L自控罐,装液量3 L∶5 L,培养温度34 ℃,pH为7,DO控制在体积分数30%左右培养9～10 h。

发酵培养:按10%接种量将种子液接种于发酵培养基,培养温度36 ℃,流加氨水控制pH为7,DO控制在体积分数30%左右培养48 h。

摇瓶培养:250 mL三角瓶装培养基20 mL,接入10%种子液,培养温度34 ℃,转速180 r/min,摇床培养48 h。

1.3 分析方法

菌体质量浓度的测定:用722N分光光度计测定600 nm波长的吸光度。

测定细胞干重:取5 mL发酵液,3 000 r/min离心,把沉淀在100 ℃下烘至恒重,称重。

葡萄糖质量浓度的测定:采用SBA-40E生物传感器进行检测发酵上清液。

腺苷产量的测定:参考文献[6-9]。

2 结果与讨论

2.1 柠檬酸钠对腺苷发酵的影响

张鑫喆等[7-8]研究表明:添加柠檬酸盐能增加HMP途径的碳流量,有利于核苷类物质的合成。通过摇瓶试验,在发酵培养基添加2 g/L的柠檬酸钠,每隔4 h取样检测,观察柠檬酸钠对细胞生长、腺苷产量及葡萄糖消耗速度的影响如图1所示。由图1可知:添加柠檬酸钠提高了腺苷的发酵水平,48 h时比不添加柠檬酸钠的腺苷产量提高了27.8%。与此同时,发酵过程中葡萄糖的消耗速度降低,48 h的残糖为5.5 g/L,对比原工艺,其48 h的残糖为1.7 g/L,对菌体生长影响不明显。

图1 添加柠檬酸钠对腺苷发酵的影响Fig.1 The effect of sodium citrate on cell growth, adenosine production and glucose consumption rate

2.2 添加柠檬酸钠对腺苷发酵的影响

通过摇瓶试验数据分析,比较腺苷的葡萄糖得率系数、葡萄糖比消耗速率和腺苷比生成速率,其结果如表1所示。添加柠檬酸钠的工艺的腺苷比生成速率比对照工艺要大,葡萄糖比消耗速率相对较小,说明添加柠檬酸钠时能增加HMP途径的碳流量,有利于提高腺苷产量和糖苷转化率。

表1 添加柠檬酸钠对腺苷产量和耗糖影响

综合表1数据分析,在5 L发酵自控罐添加柠檬酸钠进行工艺实验。培养基柠檬酸钠的添加量为2 g/L,对比发酵过程的产量、OD600和葡萄糖质量浓度如图2所示。添加柠檬酸钠发酵批次的腺苷产量为26.5 g/L,相对于不添加柠檬酸钠的产量(22.3 g/L)提高了18.83%,且葡萄糖消耗速度相对较慢,转化率得到了提高,但对细胞生长没有影响,与摇瓶试验结果一致。

图2 5 L发酵罐试验对比Fig.2 Comparison of adenosine fermentation test in 5 L fermentor

2.3 添加次黄嘌呤对腺苷发酵的影响

由微生物的补救途径[5]推测,次黄嘌呤作为腺苷合成前体物,在发酵过程添加次黄嘌呤可提高腺苷生产得率。试验设计在腺苷发酵24 h后,进行添加次黄嘌呤的摇瓶试验。由图3可知:在24 h和36 h后,分2次添加次黄嘌呤腺苷,添加3 g/L的次黄嘌呤的腺苷产量最高,可达14.9 g/L,比优化前(11.6 g/L)提高了28.45%。

在5 L发酵自控罐添加次黄嘌呤和柠檬酸钠的腺苷进行发酵试验,试验设计培养基添加柠檬酸钠,发酵过程添加前体物次黄嘌呤,可进一步提高腺苷的生产效率。发酵培养基添加为2 g/L柠檬酸钠,发酵过程在24 h和36 h分别加入次黄嘌呤3 g/L,测定发酵液的腺苷产量、OD600和葡萄糖质量浓度如图4所示。添加柠檬酸钠和次黄嘌呤的发酵工艺腺苷的产量为31.1 g/L,对比原发酵工艺(22.3 g/L)提高了39.46%,糖苷转化率提高了35%以上;对比只添加柠檬酸钠的发酵工艺(26.5 g/L),也提高了17.36%。

图3 不同质量浓度次黄嘌呤对腺苷发酵的影响Fig.3 Effects of different concentrations of hypoxanthine on adenosine fermentation

图4 添加次黄嘌呤和柠檬酸钠的腺苷发酵工艺Fig.4 Fermentation process of adenosine supplemented with hypoxanthine coupled with sodium citrate

3 结 论

添加柠檬酸钠和次黄嘌呤的发酵工艺明显提高了腺苷产量,糖苷转化率也相应得到了提高。添加柠檬酸钠使EMP途径的葡萄糖代谢通量减少,必然增加了HMP途径中葡萄糖代谢的通量,从而提高发酵的产量和转化率,笔者试验结果与文献[3-4]相同。研究表明:培养基添加柠檬酸钠(2 g/L)工艺,腺苷的产量为26.5 g/L,相对于不添加柠檬酸钠的产量(22.3 g/L)提高了18.83%;进一步提出了添加柠檬酸钠并补充次黄嘌呤前体的发酵工艺,对比原发酵工艺,腺苷的产量提高了39.46%,糖苷转化率提高了35%以上。