酶法制备不饱和果胶低聚糖及其抑菌活性研究

俞 敏,谢王玲,夏元丹,章银军

(浙江工业大学 生物工程学院,浙江 杭州 310014)

果胶低聚糖(POS)是一种新型功能性糖源,通常由2～20个半乳糖醛酸通过α-1,4-糖苷键连接而成[1],部分半乳糖醛酸也以甲酯形式存在[2]。研究表明:其具有良好的生理活性,例如抑制尿路致病微生物生长[3],促进人类结肠腺癌细胞凋亡[4],抗肥胖、抗毒性、抗感染、抗菌和抗氧化作用[5]。POS可以通过酸水解、氧化法和化学合成法等化学法制备得到[6],也可以通过酶作用于特定原料制备得到[7]。相比于化学法,酶降解法具有选择性好、副反应少和操作方便等优势[8]。果胶裂解酶(PL)作为果胶解聚酶的一种,可通过催化果胶半乳糖醛酸残基的C-4和C-5发生氢的反式消去反应来完成糖苷键裂解,产生不饱和果胶低聚糖(UPO),其富含的不饱和双键对低聚糖产物的生物活性具有显著影响[9]。目前,国内外对果胶低聚糖的研究主要体现在植物体促生长诱导活性和动物体促双歧杆菌增殖、减毒抗癌方面[10],对于其抑菌活性的研究很少,但已有研究表明POS对常见细菌具有明显的抑菌效果[11-12]。因此,研究POS的抑菌性及其与一般市售防腐剂的复配有利于开发新的抑菌防腐剂,为食品防腐提供有价值的天然抑菌防腐剂。

桔皮果渣是一种常见的农废资源,其果胶质量分数虽然高达20%[13],但因其含水率和酸度较高,极易造成微生物迅速繁殖,如不及时处理,不仅容易造成严重的环境污染,也会产生大量的资源浪费[14-15]。本研究通过单因素及正交试验优化PL酶解桔皮果渣提取UPO工艺,并对UPO进行单一和复配抑菌活性研究,实现桔皮果渣的高效增值和可持续发展,也为天然抑菌防腐剂的开辟提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株与培养基

大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)均由本实验室提供。

细菌培养基(牛肉膏蛋白胨培养基):牛肉膏3 g;蛋白胨10 g;氯化钠5 g;琼脂15～20 g;水1 000 mL;pH 7.0～7.2;121 ℃下灭菌20 min。

1.1.2 其他材料与试剂

桔皮,衢州果胶有限公司;果胶裂解酶酶液(酶活4 000 U/mL;酶活单位定义(U):在40 ℃,pH 6.8条件下,每分钟水解1%果胶,使235 nm处吸光值增加0.01的酶量定义为1个果胶裂解酶酶活单位,酶活力单位由U/mL表示),本实验室自备;活性干酵母,安琪酵母股份有限公司;DNS试剂[16]:称取182 g酒石酸钾钠,加蒸馏水定容至500 mL,加热溶解后于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3 g,氢氧化钠21.0 g,苯酚5.0 g,无水亚硫酸钠5.0 g,加热搅拌至全部溶解,加水稀释至1 000 mL,储于棕色瓶中,7～10 d后使用;所有试剂均为分析纯,上海生工生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2450型紫外可见分光光度仪,日本岛津公司;ZHWY-2112B型恒温摇床,上海智城分析仪器制造有限公司;10/5/3/1 kDa超滤膜,美国Millipore公司。

1.3 实验方法

1.3.1 不饱和果胶低聚糖(UPO)的酶法提取及质量浓度测定

将新鲜桔皮于沸水中煮沸10 min灭原酶活,过滤烘干,用高速粉碎机粉碎成粉末后过50目筛备用。取10 g干桔皮粉末加入水100 mL,用4 mol/L HCl调节pH为1.2,水浴恒温85 ℃条件下加热1 h后用两层纱布过滤溶液,调节溶液(果胶质量分数2%)pH后加入果胶裂解酶液,于摇床中反应一段时间后离心过滤得到桔皮果渣酶解粗提液。采用DNS法[17]测定还原糖质量浓度,利用紫外可见分光光度仪测定235 nm下的吸光值。还原糖得率计算公式为

式中:C1为果渣中果胶质量浓度,μg/mL;C2为酶解液中还原糖质量浓度,μg/mL;V1为酶解前液体体积,mL;V2为酶解后液体体积,mL。

1.3.2 酶法提取UPO条件优化

单因素试验:以酶解液中还原糖质量浓度为指标进行单因素试验,分别研究pH(3.2,4.2,5.2,6.2,7.2)、酶解温度(30,40,45,50,60 ℃)、反应时间(1,3,5,7,9 h)和酶添加量(添加量20,40,80,120,160 U/mL)对酶解液中还原糖质量浓度的影响。

正交试验:选取影响还原糖质量浓度的4个因素(pH、酶添加量、酶解温度、反应时间),以酶解液中还原糖质量浓度为指标进行四因素三水平的正交试验,其结果如表1所示。

表1 正交试验设计表

1.3.3 UPO的分离纯化

在酶解液中添加2%的活化安琪酵母,于30 ℃下发酵反应24 h,除去酶解液中部分单糖,离心后取上清液,向其缓慢倒入95%乙醇溶液直至溶液乙醇终质量分数为50%,静置24 h,沉淀多聚寡糖。经酵母发酵、乙醇沉淀初步处理后的酶解液通过分子质量(Mw)分别为1,3,5,10 kDa的超滤膜继续分离,得到5种不同分子质量段的酶解滤液U1(010 kDa)。

1.3.4 抑菌活性测定

试验菌株经活化培养后,用已灭过菌的移液管移取10 mL无菌生理盐水至斜面试管内,在无菌操作条件下用接种环小心将菌苔洗下。倒入带有玻璃珠的烧瓶内,将菌悬液打散,保证活菌数的均一性,稀释得到活菌数为1×107～1×108cfu/mL的菌悬液。

1) 不同分子质量段的UPO的抑菌活性测定

采用牛津杯法[18]测定不同分子质量段UPO的抑菌圈直径。首先吸取0.2 mL菌悬液至无菌固体培养基平板上,并用无菌涂布棒涂布均匀,然后将3个无菌牛津杯平稳放置于培养基表面上,保证各牛津杯之间距离相当。用移液枪移取200 μL配置好的一定浓度的UPO溶液至牛津杯中,以pH 6.8的缓冲液作为空白对照。每个分子质量段低聚糖溶液重复做3次,最后将培养皿放置于培养箱中37 ℃培养24 h。取出培养皿测量抑菌圈直径大小,并取3组实验值的平均值作为记录。

2) UPO与市售防腐剂的复配实验

取抑菌效果最佳分子质量段的UPO(质量分数2%)与市售防腐剂(山梨酸钾、苯甲酸钠和乳酸链球菌素;质量分数0.5%)以1∶1体积比复配,比较复配抑菌剂与单一组分抑菌剂的抑菌效果。采用牛津杯法测定抑菌圈直径。由于一般食品防腐剂均在酸性条件下具备良好的抑菌活性[19],故本实验抑菌剂均于pH 4.2的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中溶解,同时以pH 4.2的缓冲液作为空白对照。

2 结果与讨论

2.1 酶法提取UPO条件优化

果胶裂解酶(PL)通过β-消除反应作用于果胶底物,在新形成的非还原性末端的C-4和C-5原子间形成一个双键,该产物在235 nm处存在最大光吸收值。此外,PL在降解果胶的过程中,先降解成不饱和多聚寡糖,再解聚为不饱和低聚寡糖和部分单糖,因此,酶解液中还原糖质量浓度的多少可以作为果胶水解程度的参考指标如图1所示。

由图1(a)可知:酶添加量为20～40 U/mL时,还原糖质量浓度增加较快;酶添加量为40～120 U/mL时,还原糖质量浓度增加缓慢;酶添加量为120～160 U/mL时,还原糖质量浓度趋于稳定。反应时间越长,底物浓度越低,水解产物增多,不利于酶解反应继续进行[20]。因此,酶添加量达到一定值时,还原糖质量浓度上升速度变慢,逐渐趋于平稳,考虑后续生产成本因素,确定PL酶添加量为120 U/mL。由图1(b)可知:当pH上升至6.2时,还原糖质量浓度最大,达到880 μg/mL,之后呈下降趋势。由图1(c)可知:PL酸酶法水解桔皮果渣的适宜温度在40～50 ℃,当温度为45 ℃时,还原糖质量浓度达到最高785 μg/mL,随后还原糖质量浓度随温度升高逐渐减少,引起这一结果的原因是PL在40～50 ℃酶活较高且稳定性好,而当温度超过50 ℃时,PL酶活力明显下降,导致酶解反应减弱,还原糖质量浓度减少。由图1(d)可知:反应时间为1～5 h时,还原糖质量浓度随着反应时间增加而明显增加,当反应时间为5 h时,还原糖质量浓度趋于稳定,之后还原糖质量浓度虽有所增加,但上升趋势缓慢,由此确定PL酶解的最适反应时间为5 h。

2.2 酶法水解桔皮果渣正交试验

在单因素的基础上设计正交试验分析不同因素间的相互关系,最终确定PL酶解桔皮果渣的最佳酶解条件,其结果如表2所示。

表2 正交试验结果

通过前期实验确定反应体系中果胶质量分数为2%,故正交实验设计只考虑pH、酶添加量、反应时间和酶解温度4个因素,正交试验结果如表2所示。以还原糖质量浓度为指标,由极差分析可知:各因素对桔皮果渣酶解程度影响的主次顺序为C>D>A>B,即反应时间>酶解温度>酶添加量>pH,反应时间对还原糖质量浓度的影响最为显著。确定PL酶解果渣的最佳条件是质量分数为2%的果胶溶液,加酶量160 U/mL,反应pH 6.2,温度40 ℃,反应时间5 h。对最佳酶解工艺条件进行验证试验,得到还原糖质量浓度为1 067 μg/mL(得率为72.9%)。

2.3 不同分子质量段的UPO的抑菌活性

不同分子质量段的果胶低聚糖产物往往会产生不同的抑菌效果,通过对比抑菌圈直径,分析不同分子质量段UPO(U1,U2,U3,U4,U5)对3种常见食品污染细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)抑菌活性的影响如图2所示。

图2 不同分子质量段的UPO抑菌活性Fig.2 Antibacterial activity of unsaturated pectin oligosaccharides with different molecular weights

由图2分析可知:不同分子质量段UPO对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均具有一定的抑菌作用,但抑菌效果也存在明显差异,其中U2(1 kDa

2.4 UPO与市售防腐剂的复配实验

选取具有最佳抑菌效果的UPO(分子质量段为U2),通过对比抑菌圈直径,分析其与3种市售防腐剂单独使用和复配使用,分别对3种常见食品污染细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)抑菌活性的影响如表3所示。

表3 UPO与食品防腐剂复配抑菌活性

由表3可知:UPO及市售食品防腐剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果存在差异。单一组分的抑菌效果表明了苯甲酸钠和乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌的抑菌作用较强,而山梨酸钾则对大肠杆菌具有较好的抑制效果。UPO的抑菌性能相比于3种市售食品防腐剂较弱,但在与3种防腐剂复配后,复配抑菌剂产生的抑菌圈直径明显增大,超过3种防腐剂单独作用时的抑菌效果。可见UPO在与某种有缺陷的防腐剂复配使用后,有一定的增强该防腐剂抑菌效果的能力。因此,UPO有望与市售食品防腐剂复配使用,解决化学防腐剂的高毒性和生物防腐剂的高成本问题。

3 结 论

通过单因素及正交试验,确定了PL酶解桔皮果渣的最佳工艺条件为pH 6.2,酶添加量160 U/mL,果胶质量分数为2%,酶解温度40 ℃,时间5 h,对最佳酶解工艺条件进行验证试验,得到还原糖质量浓度为1 067 μg/mL(得率为72.9%)。不同分子质量段的UPO对常见食品污染细菌的抑菌实验表明:其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均具有一定的抑菌作用,其中U2(1 kDa