蛋白激酶R样内质网激酶通路与糖尿病肾病

庞欣欣 彭紫凝 邢玉凤 张雅歌 石秀杰 韩佳瑞

450002 郑州，河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)肾病科(庞欣欣，韩佳瑞)；450046 郑州，河南中医药大学第二临床医学院(彭紫凝，邢玉凤，张雅歌，石秀杰，韩佳瑞)

糖尿病肾病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病的严重并发症之一，是导致ESRD的重要原因，大约35%～40%的1型或2型糖尿病患者会发展为DKD[1]。DKD发病机制复杂，目前尚不完全清楚，仍需进一步深入研究其发病机制[2]。

内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在DKD发病及进展中被证实占有重要地位[3]。ERS指因某些病理因素导致内质网环境稳态被打乱的细胞内环境状态，其中未折叠蛋白反应(unfolded protein reaction，UPR)是目前研究最为广泛的一种ERS[4]。在UPR中，有3种反应感受蛋白起主导作用，其中就包括蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)。

PERK是URP发生时最先被活化的跨膜蛋白[5]。PERK可以通过磷酸化真核细胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)，并通过活化转录活化因子4(activating transcription factor 4，ATF4)，直接或间接促进下游促生存蛋白和促死亡蛋白的表达。PERK信号通路参与细胞内多种生命活动过程，在DKD发病以及进展中可能发挥重要作用[6]。本文对PERK通路在DKD发病机制中的研究进展进行综述。

一、PERK通路的生物学特征及功能

PERK是位于内质网的一种ERS跨膜感受蛋白，具有丝氨酸蛋白激酶的活性。在ERS未发生时，PERK作为与葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)结合的非活性单体存在，固定在内质网膜上，具有较为稳定的结构[7]。ERS发生时，内质网腔内大量的UPR与GRP78蛋白结合，使PERK和GRP78蛋白的结合率降低，激活PERK通路。PERK与GRP78蛋白解离后，PERK发生二聚化，并自磷酸化，激活激酶域[8]，活化的PERK可以磷酸化eIF2α，抑制蛋白质合成，继而可以恢复内质网稳态或促进细胞凋亡，激活转录因子ATF4，在细胞内多种生命活动过程中起着关键作用。

一方面，在轻度激活的PERK通路中，ATF4上调诱导磷酸化eIF2α的下游靶点-生长停滞与DNA损害可诱导基因34(growth arrest and DNA damage inducible protein 34，GADD34)磷酸酶的活性，GADD34表达可以通过去磷酸化eIF2α负反馈调节PERK通路，提高蛋白质折叠能力，促进PERK与GRP78蛋白结合，减轻ERS。与此同时，ATF4可以进一步激活自噬、抗氧化反应、氨基酸的合成和转运，促进细胞生存[9]。另一方面，当PERK通路被持续激活时，ATF4水平持续上调，不仅激活GADD34，还能促进C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)基因的表达，其表达活化了细胞凋亡途径[10]。在此过程中，ATF4-CHOP异二聚体启动修复mRNA翻译，导致蛋白质合成增加，促进氧化应激和细胞凋亡[9]。

PERK通路参与机体对应激因素的反应过程，可通过PERK通路不同部位的特异性调节，干预细胞存活或死亡。例如，PERK直接抑制剂GSK 2656157可以抑制PERK蛋白的表达，调节PERK通路参与的各种应激反应[11]。ERS抑制剂4PBA可以干预细胞eIF2α磷酸化，下调CHOP蛋白表达，参与整体调控PERK通路[12]。综合应激反应抑制剂ISRIB，可以通过抑制雌激素受体，来抑制ATF4的表达，调节PERK通路，阻断UPR激活[13]。Guanabenz和Sephin1可以选择性地抑制体内蛋白磷酸酶1的亚基，作用于GADD34使eIF2α持久磷酸化，参与PERK通路的调节[14]。选择性CHOP激动剂Sulfonamidebenzamides可以上调转录因子CHOP的mRNA表达，参与调控PERK通路等[15]，以上都可能通过精细调节PERK通路来干预细胞的存活或死亡。

二、PERK通路与DKD发病机制

在DKD中，多种因素如糖脂代谢紊乱、炎症、晚期糖基化终产物(advanced glycation end-products，AGEs)、血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)等均可以导致ERS的发生，诱导UPR反应，进而激活PERK通路[16]。适度的PERK通路激活能够通过促进ATF4形成，激活GADD34，缓解PERK自磷酸化，参与机体稳态的调节。但过度激活可破坏PERK通路平衡，增加 ATF4产生，上调CHOP蛋白表达，促进炎症因子、活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)形成，进而诱导足细胞损伤或凋亡，促进胶原沉积等，加重DKD。同时PERK通路的过度激活，还可通过ATF4抑制细胞自噬功能，加重DKD进展[9]。(图1)

注：AGEs：晚期糖基化终产物；Ang Ⅱ：血管紧张素Ⅱ；GRP78：葡萄糖调节蛋白78；ERS：内质网应激；eIF2α：真核细胞起始因子2α；ATF4：转录活化因子4；ROS：活性氧自由基；GADD34：生长停滞与DNA损害可诱导基因34；Bax：Bcl-2相关X蛋白；CHOP：C/EBP同源蛋白；DKD：糖尿病肾病；GSK 2656157为PERK抑制剂；ISRIB为ATF4抑制剂；Sulfonamidebenzamides为CHOP激动剂；Guanabenz、Sephin1为GADD34抑制剂。图1 PERK通路与DKD发病机制

1.PERK通路与细胞凋亡 细胞凋亡是一种可由多种途径诱发的细胞程序性死亡，与DKD肾脏损害密切相关。不少研究证实了PERK通路参与调控DKD细胞凋亡的发生[17]，抑制PERK通路可以保护细胞，阻止细胞凋亡。Chen等[18]研究发现PERK通路的激活参与DKD足细胞凋亡的过程，黄芪甲苷Ⅳ可以通过下调PERK-ATF4-CHOP通路来阻止ERS诱导的足细胞凋亡。Huang等[19]研究证实抑制PERK通路可以阻止肾小管上皮细胞凋亡，在DKD小鼠中，羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解蛋白1过表达可以降低磷酸化eIF2α的表达，抑制PERK通路，阻止了肾小管上皮细胞凋亡。

但是，也有研究发现阻断PERK通路可能会促进细胞凋亡。Ji等[20]研究表明，在ERS发生时，PERK在人骨肉瘤细胞中高表达，敲除PERK导致细胞中GRP78蛋白增加，磷酸化eIF2α水平上升，促进CHOP蛋白的表达和上调caspase-3蛋白水平，导致人骨肉瘤细胞凋亡，表明阻断PERK通路可以促进人骨肉瘤细胞凋亡。但在DKD中，目前普遍认为PERK通路发挥促凋亡作用，尚未有文献在DKD中报道PERK通路能抑制细胞凋亡，阻断PERK通路导致的细胞凋亡可能是DKD的治疗靶点。

2.PERK通路与炎症 炎症在DKD的发病机制中起着至关重要的作用[21]。不少研究证实下调PERK通路可以抑制炎症。Hu等[22]认为，DKD中有大量炎症因子或促炎因子，刺激ERS发生，PERK通路在内质网腔被激活，PERK蛋白表达上调，磷酸化eIF2α水平上升，连接蛋白43表达下调，继而肾功能下降，一种大黄酸和L-精氨酸合成的新化合物可以通过抑制PERK蛋白表达，下调PERK-eIF2α通路，减弱内质网应激，上调连接蛋白43表达，继而减少DKD中的促炎因子，减缓DKD发病进展。Chen等[23]认为，PERK通路参与了DKD的炎症进程，在DKD中，AGEs进一步促进GRP78蛋白表达上调，PERK磷酸化，炎症因子白介素-6(interleukin-6，IL-6)等因子增加，牡丹皮萜苷类成分可以下调GRP78蛋白和磷酸化PERK表达，抑制PERK通路，减少IL-6等相关炎症因子，减弱DKD中ERS相关炎症。

然而，阻断PERK通路也可能加重DKD的炎症反应。Guthrie等[24]研究发现，PERK通路在炎症中具有双重调节作用，一方面PERK抑制剂作用于星形胶质细胞，证实PERK抑制剂可以下调PERK通路中ATF4和CHOP的表达，导致ERS 诱导的炎症因子IL-6、趋化因子2(chemokine 2，CCL2)和 CCL20减少，另一方面，完全敲除PERK后阻断了依赖性UPR反应，减少ERS诱导的IL-6表达，但是没有减少ATF4和CHOP蛋白的表达，反而加重了炎症反应，为研究阻断PERK通路可促进DKD炎症反应提供理论依据。但目前来看，PERK通路抑制炎症的研究较少，而PERK通路激活促进DKD的炎症机制已被较多研究证实。我们推测，在DKD中，各种因素导致的持续ERS使得PEKR通路的激活可能是DKD作为免疫炎症性疾病的重要病因。

3.PERK通路与氧化应激 ROS是需氧细胞在代谢过程中产生的一系列活性氧集簇，ROS广泛存在于DKD患者中，ROS产生同时抗氧化物质减少，造成肾组织的氧化应激状态[25]，在DKD发病过程中发挥重要作用。大量研究证实，抑制PERK通路可以减弱氧化应激。Cao等[26]研究表明，在DKD中，ERS发生促进ROS产生，内质网应激抑制剂熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)抑制肾小球和肾小管中GRP78蛋白的表达，并进一步下调磷酸化PERK和CHOP蛋白的表达，因此UDCA可以抑制PERK通路并减少高糖诱导下足细胞产生的ROS，减弱ERS诱发的氧化应激，延缓DKD进展。林浩飞等[27]认为，PERK通路影响细胞氧化应激，十溴联苯醚诱导的小鼠海马神经元细胞中，GRP78蛋白和PERK表达上调，CHOP蛋白和Bcl-2升高，PERK通路激活，氧化指标超氧化物歧化酶显著降低，一氧化氮和丙二醛升高，表明氧化应激水平上调，证实PERK通路参与细胞中氧化应激，抑制PERK通路可以减缓细胞内氧化应激。Verfaillie等[28]研究证实，在ROS介导的ERS过程中，PERK通路通过维持促凋亡CHOP蛋白的水平和促进内质网和线粒体之间ROS信号的传播而促进细胞死亡，因此在PERK减少的细胞中CHOP蛋白表达降低，细胞凋亡减弱，同时氧化应激介导的线粒体损伤减弱，这表明抑制PERK通路能够减缓细胞内氧化应激，进而阻止细胞损伤。也有研究发现，低剂量ERS诱导剂TM可以激活适度的ERS发生，激活PERK通路来减轻糖尿病心脏缺血/再灌注损伤[29]。说明PERK通路在DKD氧化应激损伤的双面性。大多数研究表明，在DKD中PERK通路可以促进ROS产生，抑制PERK通路可以减弱氧化应激，缓解DKD。

4.PERK通路与自噬 自噬是发生在细胞内的一种适应性改变的分解代谢过程[30]。在DKD发病过程中，自噬与多种细胞损伤有关[31]。目前多数研究表明，抑制PERK通路可以促进细胞自噬。Fang等[32]研究表明，PERK通路的激活参与调节DKD中的自噬，而内质网抑制剂可以通过下调PERK通路，减缓eIF2α磷酸化，下调促凋亡的CHOP基因的表达，增加自噬相关蛋白表达以恢复DKD中受损的自噬功能。Chiang等[12]研究证实，AGEs能够诱导DKD系膜细胞ERS发生，进一步激活eIF2α的磷酸化，上调GRP78、ATF4和CHOP蛋白表达，而内质网应激阻断剂4-苯基丁酸通过下调PERK-ATF4-CHOP通路来激活自噬，进而阻止了细胞凋亡，因此，抑制PERK通路可以刺激自噬保护细胞，缓解DKD进展。

阻断PERK通路也有可能抑制细胞自噬。Wang等[33]研究发现，PERK通路可以调控自噬激活，如肾脏近曲小管细胞在铅诱导下发生ERS，促使PERK磷酸化继而激发eIF2α-ATF4 -CHOP通路，激活PERK通路，显著抑制细胞中自噬通量，促进铅诱导的细胞凋亡，从而产生肾毒性，而敲除PERK阻断PERK通路后，自噬标记蛋白水平和自噬小体积累明显降低，因此阻断PERK通路会损伤细胞自噬进而导致肾毒性。钟申熹等[34]研究认为，以PERK通路抑制剂预处理人骨肉瘤细胞后行光动力疗法处理，PERK通路受到阻滞，下游信号分子ATF4表达降低，同时自噬相关蛋白表达降低，自噬活性受到抑制。这些研究为阻断PERK通路导致自噬抑制进而加重DKD进展提供了理论依据。就目前研究，PERK通路激活抑制DKD的自噬已被证实。我们推测，在DKD中，持续ERS发生而激活PEKR通路可能导致DKD自噬功能被抑制或丧失，进而促进疾病发生。阻断PERK通路能否抑制自噬进而加重DKD仍缺乏文献报道，尚有待进一步研究。

5.PERK通路与血管紧张素Ⅱ AngⅡ在DKD发展中起到中心作用[35-36]。适度下调PERK通路减少AngⅡ的产生，减缓DKD进展，吕振嵘等[37]研究表明，AngⅡ可以诱导心肌细胞的PERK、eIF2α和CHOP蛋白表达升高，细胞中ERS激活PERK-eIF2α通路进一步参与AngⅡ诱导心肌细胞的肥大过程，并且促进CHOP介导的细胞凋亡途径，因此PERK通路参与AngⅡ诱导的细胞损害。Liu等[38]研究表明，血管紧张素I型受体阻滞剂可抑制AngⅡ介导的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)合成，特异性VEGF受体抑制剂SU5416可以下调磷酸化VEGF受体和磷酸化PERK的表达，可以通过下调PERK通路，抑制VEGF来影响AngⅡ，保护足细胞，治疗DKD。Ha等[39]研究证实，AngⅡ可以通过增加磷酸化PERK和ATF4蛋白，激活PERK通路，诱导内质网上PERK-eIF2α-ATF4通路上调，导致足细胞损伤。所以在DKD中，PERK通路不仅可以调节AngⅡ的生成，而且参与AngⅡ的致病机制。以上研究表明，可以通过下调PERK通路来抑制ERS，减少AngⅡ的产生，缓解DKD。

6.PERK通路与其他 PERK通路可能通过影响多种因素，参与DKD的发病以及进展。Park等[40]研究证实，在DKD中，PRMT1表达诱导促进PERK通路上调，激活磷酸化eIF2α，促使CHOP蛋白表达，所以下调PERK通路可以抑制PRMT1的表达，阻止在DKD中ERS诱导的系膜细胞凋亡，缓解DKD。Pei等[41]研究发现高脂饮食能通过PERK通路加重小鼠胰岛素抵抗。Bao等[42]研究发现PERK通路参与了高糖诱导的肾小管上皮细胞上皮间充质转分化过程。

从ERS的功能角度来看，适度的激活PERK通路可以发挥保护作用，而过强或者长时间的激活可能加重损伤。但是，由于PERK通路的机制和功能复杂性，研究结果尚不完全一致。一些研究在其他疾病模型中证实了PERK通路的保护作用，但在DKD中，多数研究认为PERK通路的激活可以通过诱导凋亡、促进炎症、抑制自噬、促进氧化应激损伤等机制发挥致病作用，阻断PERK通路引起的各种损伤机制已被证明是不少新型DKD治疗药物的潜在机制。

三、结语

综上所述，已有大量研究表明，PERK通路可以调控细胞凋亡、炎症、氧化应激、自噬、AngⅡ等，在DKD的发病和进展中发挥重要作用[36，43]。未来研究可以通过(1)直接促使药物作用于肾脏细胞中PERK通路，使PERK通路下调保护细胞，延缓DKD发病；(2)反向利用药物，寻找合适的药物阻断对肾脏有损害的细胞中PERK通路，以此来减少对肾脏有损害的细胞，达到治疗DKD的目的；(3)可以通过药物特异性作用于PERK通路的上游或下游分子，如PERK通路的抑制剂ISRIB等等，抑制ATF4调控PERK通路在DKD中的作用，进而阻止DKD进程。简而言之，对PERK通路的精细调控，可以有效防治DKD。我们可以更进一步的挖掘PERK通路在DKD中的作用，为DKD的防治提供更有效的治疗靶点。