不同刺激方式对在体和离体蛙腓肠肌单收缩影响的定量分析*

许培宏, 唐 凤, 王雪薇，王 欢, 李少垒, 沈建新, 江 玲, 陈 穗, 王海燕

(1.汕头大学医学院，2.汕头大学医学院机能学实验室，3.汕头大学医学院病理生理学教研室，4.汕头大学医学院生理学教研室，广东 汕头 515041)

观测不同强度电刺激对蛙腓肠肌收缩的影响是生理学和机能学实验中的经典项目，有的采用离体标本(invitrospecimen)，有的采用在体标本(invivospecimen)，但一般都使用间接刺激(indirect stimuli，即通过刺激支配腓肠肌的坐骨神经引起肌肉的收缩)[1, 2]。在体标本和离体标本的实验效果是否有不同？如将间接刺激改为直接刺激(direct stimuli，即刺激信号直接作用于肌肉)，效果是否一样？目前尚无对此两个问题的定量研究。本工作分别制备在体和离体蛙腓肠肌标本,并分别施以间接电刺激(通过坐骨神经施加刺激)或直接电刺激(刺激电极用细针灸针,直接刺入腓肠肌中施加刺激)，用生物机能实验系统(BL-420F)实时记录不同强度刺激对肌肉收缩的影响；后续通过自编程辅助处理分析肌肉收缩数据，对单收缩特征参数进行定量比较分析，以便对上述两个问题作出明确回答。本工作实验结果对于相关实验教学和研究时标本和刺激方式的选取将有重要的指导意义。此外，给予萎缩肌肉和运动神经纤维电刺激的方法已经普遍应用于临床康复医学，研究相关刺激参数对骨骼肌收缩特性的影响对于临床指导肌萎缩或神经运动纤维损伤康复将可提供有益的实验基础[3-6].

1 材料与方法

1.1 实验动物

牛蛙，雌雄不拘，健康有活力，体重约100 g；共40只。

1.2 主要实验仪器和试剂

常用蛙类手术器械、任氏液点滴装置(自制)、张力换能器、铁支架、三通管、直接刺激电针(自制)、生物机能实验系统BL-420F(含硬件、软件和配件，均购自成都泰盟软件有限公司)、标准任氏液等。

1.3 标准任氏液的配制

按照标准任氏液的配方配制标准任氏液。溶液的配制遵照标准的操作规程，采用双蒸水配制，当天配制当天使用[1,2,7]。

1.4 实验装置连接

间接刺激装置连接(图1A)：刺激输出(stimulus output)通过保护电极作用于在体标本(或离体标本)的坐骨神经；直接刺激装置连接(图1B): 刺激输出通过细针灸针刺入腓肠肌，直接给腓肠肌电刺激。张力换能器与BL-420F系统的通道1连接。(图1A、B)

Fig. 1 Diagram of experimental device

1.5 实验方案

分四个组：(1)间接刺激在体标本组，简称在体间接组(vivo-ind，n=12)；(2)直接刺激在体标本组，简称在体直接组(vivo-dir，n=8)；(3)间接刺激离体标本组，简称离体间接组(vitro-ind，n=12)；(4)直接刺激离体标本组，简称离体直接组(vitro-dir，n=8)。

按常规方法分别制备蛙坐骨神经-腓肠肌在体和离体标本[1,2]，之后分别对标本施加间接刺激或直接刺激，通过BL-420F生物机能实验系统的第1通道(channel 1)记录由刺激引起的腓肠肌收缩张力信号。间接刺激由保护电极作用于支配腓肠肌的坐骨神经从而引起腓肠肌收缩，而直接刺激由两根细针灸针组成的刺激电极直接刺入腓肠肌中施加刺激。这两种刺激电极分别连接到BL-420F实验系统刺激输出端口; 刺激输出参数设置如下[1, 2, 8]：程控单刺激，波宽0.05 ms，延时100 ms，采样率1 KHz，强度从0 V开始，周期3 s，增量0.02 V，最大刺激不超过3 V。实验过程中通过自制装置匀速滴加任氏液以保持标本活性。

1.6 统计学处理

采用上述方案，用BL-420F所记录的实验数据量较多，后续可导出数据到TXT文件中，再用第三方软件(本工作用EXCEL VBA)编程辅助对TXT文件中的数据进行批量计算，从而较快速准确实现对各组数据的定量处理分析，由此可获得肌肉收缩幅度-刺激强度关系曲线并得到各组数据的阈强度、半高强度和最适强度以及最大单收缩幅度、收缩期、上升斜率等重要参数。其中，腓肠肌的收缩幅度从无到有所对应的刺激强度，即使肌肉产生可测量收缩幅度的最小刺激强度，称为阈强度；当肌肉的收缩幅度不再随着刺激强度的增大而增大时，对应的临界刺激强度，即使肌肉收缩达到最大幅度的最小刺激，称为最适刺激强度[1,2]；而当肌肉收缩达到最大收缩幅度的一半时所对应的刺激强度，称为半高刺激强度。数据统计视需要采用方差分析或t检验。

2 结果

2.1 间接刺激对在体腓肠肌标本的单收缩影响

采用前述方法，对在体蛙坐骨神经-腓肠肌标本施以间接刺激(属vivo-ind组)，由此可获得肌肉收缩幅度-刺激强度关系曲线(图2A)。分析此幅度-强度关系曲线可知：随着强度不断增大，腓肠肌的收缩幅度从无到有，从小到大，增大到一定程度后不再随着刺激强度的增大而增大，保持幅度基本稳定不变，呈一个长尾S型曲线。在本例中，阈强度为 0.38 V(图2A，2B中的①)；半高刺激强度为0.42 V(图2A，2B中的②)；最适刺激强度为1.44 V(图2A，2B中的③)。选取腓肠肌的收缩幅度达到最大的波形(如图2B中的④)进行精细测量，可得到腓肠肌单收缩的收缩期、舒张期、收缩上升斜率等重要参数(图2C)。

2.2 间接刺激和直接刺激对在体腓肠肌标本单收缩特性的影响

为探究在体标本中，间接刺激与直接刺激对肌肉收缩性能有何不同影响，我们采用与2.1所述相同的刺激设置方案进行实验和分析，结果发现：(1)在体蛙腓肠肌在间接刺激下(属vivo-ind)产生单收缩的阈强度、半高刺激强度和最适刺激强度均小于在直接刺激下(属vivo-dir)产生单收缩的阈强度、半高刺激强度和最适刺激强度(P<0.05)。(2)在体蛙腓肠肌在间接刺激作用下产生的最大单收缩幅度和收缩期均大于在直接刺激作用下产生的最大单收缩幅度和收缩期(P<0.05)；最大单收缩半高宽和舒张期则无明显差异。(3)在体蛙腓肠肌在间接刺激作用下产生最大单收缩的上升斜率小于在直接刺激下产生最大单收缩的上升斜率(P<0.05)；但下降斜率、上升斜率/下降斜率的比值则无明显差异(表1, 图3)。

Fig. 2 Typical results and analysis(take one with indirect stimuli in vivo as an example)

Tab. 1 Comparison of vivo-ind and vivo-dir group )

2.3 间接刺激和直接刺激对离体腓肠肌标本单收缩特性的影响

为探究离体标本中，间接刺激与直接刺激对肌肉收缩性能有何不同影响，我们采用与2.1所述相同的刺激设置方案进行实验和分析，结果发现：(1)离体蛙腓肠肌在间接刺激下(属vitro-ind)产生单收缩的阈强度、半高刺激强度和最适刺激强度均小于在直接刺激下(属vitro-dir)产生单收缩的阈强度、半高刺激强度和最适刺激强度(P<0.05)。(2)离体蛙腓肠肌在间接刺激作用下产生的最大单收缩幅度和收缩期均大于在直接刺激作用下产生的最大单收缩幅度和收缩期(P<0.05)；最大单收缩半高宽和舒张期则无明显差异。(3)离体蛙腓肠肌在间接刺激作用下产生最大单收缩的上升斜率小于在直接刺激下产生最大单收缩的上升斜率(P<0.05)；但下降斜率、上升斜率/下降斜率的比值则无明显差异。(表2, 图4)

Fig. 3 The effects of indirect and direct stimuli on the averaged wave pattern of twitch in vivo

Tab. 2 Comparison of vitro-ind and vitro-dir group

Fig. 4 The effects of indirect and direct stimuli on the averaged wave pattern of twitch in vitro

2.4 间接刺激对在体和离体腓肠肌标本单收缩特性的影响

为探究间接刺激下，在体标本与离体标本的肌肉收缩性能有何不同，我们比较分析了相应的实验结果，发现：(1)在体蛙腓肠肌和离体蛙腓肠肌在间接刺激下产生收缩的阈强度、半高刺激强度和最适刺激强度均无明显差异。(2)在体蛙腓肠肌和离体蛙腓肠肌在间接刺激下产生的最大单收缩幅度、半高宽、舒张期和收缩期也均无明显差异。(3)在体蛙腓肠肌和离体蛙腓肠肌在间接刺激下产生的最大单收缩的上升斜率、下降斜率和上升斜率/下降斜率的比值也均无明显差异(表3, 图5)。

Tab. 3 Comparison of ind-vivo and ind-vitro group n=12)

Fig. 5 The effects of indirect stimuli on the averaged wave pattern of twitch in vivo and in vitro

2.5 直接刺激对在体和离体腓肠肌标本单收缩特性的影响结果比较

为探究直接刺激下，在体标本与离体标本的肌肉收缩性能有何不同，我们比较分析了相应的实验结果，发现：(1)在体蛙腓肠肌和离体蛙腓肠肌在直接刺激下产生收缩的阈强度、半高刺激强度和最适刺激强度均无明显差异。(2)在体蛙腓肠肌和离体蛙腓肠肌在直接刺激下产生的最大单收缩幅度、半高宽、舒张期和收缩期也均无明显差异。(3)在体蛙腓肠肌和离体蛙腓肠肌在直接刺激下产生的最大单收缩的上升斜率、下降斜率和上升斜率/下降斜率的比值也均无明显差异(表4, 图6)。

Tab. 4 Comparison of vivo-dir and vitro-dir group n=8)

Fig. 6 The effects of direct stimuli on the averaged wave pattern of twitch in vivo and in vitro

3 讨论

如前所述，本研究的目的旨在通过定量实验数据分析探讨如下两个问题：(1)不同强度刺激对在体和离体蛙腓肠肌单收缩实验的效果是否有不同影响？(2)如将常用的间接刺激(即通过刺激坐骨神经引起腓肠肌收缩)改为直接刺激(即刺激信号直接作用于肌肉)，效果有无不同？

为达到此目的，我们在实验方法上作了一定的创新：(1)任氏液滴加装置：由于同一标本的实验持续时间较长，为保证标本的活性，我们通过反复实践自制了一套任氏液点滴装置：利用常规输液管，加装一个三通管，同时同步以固定频率和固定流量给肌肉和神经持续滴加任氏液。此装置可避免实验过程中不必要的人为介入，肌肉的活性良好，提高了实验成功率。(2)直接刺激电针：文献中未发现有关于直接刺激牛蛙腓肠肌引起肌肉收缩方法的报道。临床上，有采用体表电极刺激肌肉的运用[9]，但由于牛蛙腓肠肌体积小，接触面小，体表与人体不同，不适合使用体表电极。最终，我们借鉴有关直接刺激家兔眼轮匝肌重建肌肉性能的实验[10]，设计研究出一套适用于牛蛙腓肠肌的直接刺激装置：将两枚直径0.35 mm针灸针分别与裸露的细软铜电线焊在一起，用电工胶布将两枚针灸粗端针近端包裹隔离避免短路；针灸针暴露的远端平行插入肌肉后就形成了电流回路，直接刺激肌肉，实验证明效果良好。(3)刺激输出和数据记录及处理分析方面，我们将由生物机能实验系统(BL-420F)记录得到的原始数据导出为文txt文件，之后再用EXCEL VBA编程辅助对txt数据文件进行统一规范自动化的处理分析。这样可更高效地得到肌肉收缩相关的阈强度和最适刺激强度及肌肉单收缩曲线，且结果更精准，有利于定量比较分析。

通过统一规范的数据定量处理和分析比较，我们发现：(1)对在体标本，与直接刺激比较：间接刺激的阈强度、半高强度和最适强度均更小(P< 0.05)；最大单收缩幅度更大，收缩期更长，上升斜率更小(P<0.05)(对在体标本施加间接刺激的例数为12，施加直接刺激的例数为8)。(2)对离体标本，与直接刺激比较：间接刺激的阈强度、半高强度和最适强度也均更小(P<0.05)；最大单收缩幅度更大，收缩期更长，上升斜率更小(P<0.05)(n离体间接=8,n离体直接=8)。(3)均采用间接刺激或直接刺激时，与离体标本比较，在体标本单收缩的各项参数均无差异(P>0.05)。

上述这些结果表明，虽然间接刺激和直接刺激都可以引起肌肉收缩，但通过刺激神经间接引起肌肉收缩的效率更高(阈强度和最适刺激强度更小，而最大单收缩幅度更大)，可能是因为间接刺激通过神经纤维末梢、以运动单位[11,12]的形式可更方便地动员更多的肌肉纤维参与收缩，因而更敏感，收缩力也更大。在本研究(性实验)中，只要刺激方式相同(都是间接刺激或都是直接刺激)，在体标本和离体标本对骨骼肌收缩的相关特性指标无明显差异；但从标本制备和实验的实施方便性方面考虑，在体标本更易制备，更方便较长时间保持其活性，更有实用优势；而如果要进行给药冲洗实验，则离体标本更有优势。后续在进行相关研究时，可考虑延长标本的使用时间并检测其活性，以获得关于在体标本和离体标本在肌肉收缩性能方面有何不同的更确切的数据。

综上所述，本研究结果对于相关实验教学和研究时骨骼肌标本(在体或离体)和刺激方式(间接或直接)的选取有重要的指导意义，而如能在相关实验中如本文一样引入定量比较分析的方法则可使实验结果更准确可信。