环状GMP-AMP合成酶高表达对乳腺癌细胞上皮间质转化的影响*

张晓金，张文霞，朱吉玲，罗文盼

(1.江苏医药职业学院，盐城 224004；2.甘肃省人民医院，兰州 730000；3.绍兴文理学院，浙江 绍兴 312000)

尽管人类在乳腺癌治疗方面已取得重大进展，但乳腺癌仍然是最常见的癌症之一，是全球妇女死亡的主要原因[1]。即使目前治疗方法不断进步，但是乳腺癌的发病率和死亡率仍然处于上升态势[2]。乳腺癌侵袭转移是乳腺癌患者死亡的关键所在。目前普遍认为，乳腺癌是一种多基因、多步骤参与的复杂疾病。上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)机制一直以来都是探讨恶性肿瘤转移的热点话题。EMT是指在特定的生理、病理状况下，上皮细胞会暂时失去极性，表现出间质细胞所具有的迁移特征，即上皮细胞出现细胞极性丧失、黏附能力下降及细胞拉长等间质表型特征。研究表明，EMT与乳腺癌的侵袭转移显著相关，乳腺癌细胞通过EMT获得转移迁移能力，侵袭周围或远处组织，成为转移性肿瘤[3]。在EMT过程中，肿瘤细胞频繁出现上皮标记蛋白(E-cadherin)表达水平降低，间质标记蛋白(N-cadherin)表达水平的上调[4],因此可以把这两种免疫标记物的表达情况作为细胞发生EMT的指标。E-cadherin具有细胞黏附及信号转导的双重作用，是维持上皮表型的重要黏附分子，该蛋白的缺失使细胞间的黏附下降，并促使β-连环蛋白发生易位，进一步激活相关信号通路，最终诱导N-cadherin的表达上调，E-cadherin的下调及N-cadherin的高表达与肿瘤低分化、高侵袭力密切相关[5]。近年研究发现，环状GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)信号传导通路与多种肿瘤发生密切相关。例如，有研究表明cGAS可通过检测微核，从而在维持细胞稳态及监控癌症方面发挥重要作用[6]。本实验将构建高表达cGAS的慢病毒载体，转染乳腺癌细胞，探讨cGAS通路对乳腺癌细胞增殖、迁移能力及EMT过程的作用机制,旨在寻求调控乳腺癌发展的新靶点，为临床乳腺癌的诊断治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株

乳腺癌MCF7细胞株购于上海细胞库；

1.2 主要试剂

DMEM培养基(Hyclone)、胎牛血清(Gibco)、兔抗人cGAS单克隆抗体(Cell Signaling)、兔抗人STING单克隆抗体(Cell Signaling)、兔抗人单克隆抗体NF-κB(Cell Signaling)、兔抗人TANK单克隆抗体(Abcam)、兔抗人E-cadherin单克隆抗体(Abcam)、兔抗人N-cadherin单克隆抗体(Abcam)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG的抗体(碧云天)，MTT试剂购自美国Promega公司。cGAS载体构建及慢病毒包装由GenePharma公司完成。

1.3 建立稳定高表达cGAS的细胞株及分组设计

将MCF7细胞消化计数后均匀接种到12孔板中，设阴性对照组(NC组)和处理组(MCF7-cGAS)，处理组加入含cGAS的慢病毒，NC组加入等量空载慢病毒。培养过夜，待细胞生长达到30%～40%时，弃掉旧培养液，更换配置好的转染混合液，继续培养过夜，更换正常培养液，培养48 h后加入嘌呤霉素，筛选出稳定高表达cGAS的细胞。

1.4 MTT检测细胞增殖

将NC组细胞和处理组细胞消化后，接种于96孔板中，2 000 cells/well，严格控制细胞数目，每个孔做4个重复，分别培养12 h，24 h，48 h，72 h，加入MTT(5.0 g/L)50 μl/well、置入培养箱孵育4 h，离心弃上清，加入二甲基亚砜200 μl，采用酶联免疫检测仪测定各孔吸光值，评价细胞存活率。酶标仪490 nm波长处测定吸光度(OD)值，绘制细胞生长曲线。

1.5 Transwell 检测细胞迁移能力

分别制备NC组和MCF7-cGAS组单细胞悬液(无血清培养液)，以1×105cells/ml加至24孔Transwell小室上部孔中，下部腔室中加入50 μl含10%胎牛血清的培养液，在37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h后，收集穿过下室并铺展在下膜表面上的细胞，结晶紫染色，计数每个膜的迁移细胞数目，计算迁移率，迁移率(%)=(迁移细胞数/总细胞数×100%)

1.6 Western blot检测蛋白表达水平

取NC组及MCF7-cGAS组细胞提取蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度并将样本蛋白稀释至适宜浓度，SDS-PAGE电泳2 h，转膜1.5 h，转膜后用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤后加二抗孵育1 h，β-actin做内参。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 构建高表达cGAS 的乳腺癌细胞系的鉴定

将对照空载体病毒和高表达cGAS慢病毒分别感染MCF7细胞48 h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达，并用嘌呤霉素筛选2周，在荧光显微镜下观察，可见各组细胞GFP阳性率均在90%以上。蛋白质印迹结果也表明MCF7细胞感染后cGAS蛋白表达增高，结果表明成功构建MCF7-cGAS细胞系(图1)。

Fig. 1 Effective lentiviral vector were transfected into breast cancer cells MCF7

2.2 cGAS高表达对MCF7细胞形态学的影响

将对照组和MCF7-cGAS组细胞分别培养24 h后，光学显微镜观察细胞，与对照组相比，MCF7-cGAS组细胞形态发生明显改变(图2)。细胞形态由鹅卵石样转变为梭形，该特征为癌细胞发生上皮-间质转化的表现之一。

Fig. 2 Effects of cGAS over expression on morphological characteristics of MCF7 cells(×200)

2.3 cGAS高表达对乳腺癌细胞增殖能力的影响

MTT检测结果显示，MCF7-cGAS组细胞在12 h、24 h、48 h、72 h的OD值(分别为0.379±0.012，0.516±0.019,0.854±0.032,1.154±0.027)均显著高于对照组细胞对应时间点的OD值(0.221± 0.009，0.383±0.017，0.648±0.024，0.904±0.019，P<0.05，图2)。

Fig. 3 Effects of cGAS overexpression on viability of MCF7 cells n=3)

2.4 cGAS高表达对乳腺癌细胞迁移能力的影响

MCF7-cGAS细胞组在48 h的迁移率为 61.58%，明显高于对照组的迁移率28.9%(P< 0.05，图4)。

Fig. 4 Effects ofcGAS overexpression on migration of MCF7 cells by transwell assay(×200)

2.5 cGAS高表达对乳腺癌细胞上皮间质转化相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与NC组相比，MCF7-cGAS细胞组EMT标记蛋白E-cadherin的表达水平降低，N-cadherin表达水平增高(P<0.05，图5，表2)。

Fig. 5 Expressions of E-cadherin and N-cadherin detected by Western blot

Tab. 1 Relative protein expressions of E-cadherin and N-cadherin in the MCF7 cells by Western blot n=3)

3 讨论

cGAS-STING信号通路最初是作为天然免疫系统的一个重要组成部分被发现，其功能是检测胞浆DNA的存在，并在反应中触发炎症基因的表达[7-9]。之前诸多研究主要探索cGAS在固有免疫细胞中的功能与调节机制，近年来的研究显示cGAS在肿瘤中也发挥重要调节作用。当肿瘤细胞胞质DNA泄露后，易被cGAS识别，激活下游IFN应答[10]。Ⅰ型IFN应答能够作为刺激肿瘤反应的关键诱导剂, 且其上游cGAS-STING信号通路也可以在特定阶段促进肿瘤的发生和发展。在非炎性路易斯肺癌(Lewis lung cancer，LLC)小鼠模型中cGAS-STING通路激活与肿瘤生长有关[11]。本研究结果显示，cGAS高表达后乳腺癌细胞发生上皮间质转化，提示其在乳腺癌中可能发挥调节作用。

新近研究发现染色体不稳定性通过维持肿瘤细胞对胞质 DNA 的自主反应来促进转移。染色体不稳定的癌细胞会产生大量DNA 碎片通过微核分泌到细胞质中，一旦细胞质内出现 DNA 碎片，就会激活 cGAS-STING 通路，但随后不会激活经典的 NF-κB 通路。相反，cGAS-STING 通路会激活非经典的 NF-κB 通路，促使 p52 基因的表达，使癌细胞的基因表达特征与骨髓先天性免疫细胞具有某些相似性，并且可逃避 T 细胞的追杀，抑制cGAS-STING 通路可显著抑制癌细胞转移[12]。cGAS-STING 信号的激活也会刺激 PD-L1 在癌细胞中表达，从而介导癌细胞的免疫逃逸[13]。Chen 等发现连接蛋白43和原钙黏蛋白7介导cGAMP 通过缝隙连接从肿瘤细胞转移到星形胶质细胞，随后诱导IFN和NF-κB的表达, 促进脑转移[14]。本研究中cGAS高表达后增强乳腺癌细胞的增殖和迁移能力。上皮间质转化(EMT)是肿瘤性上皮细胞向间质细胞转化的生物学过程，是恶性肿瘤侵袭和转移的重要步骤。例如，在关于胃癌和髓母细胞瘤的研究报道，减缓EMT进程，可抑制癌细胞侵袭[15，16]。本研究发现，cGAS高表达可增加N-cadherin表达，降低E-cadherin表达，促进EMT进程，这可能是cGAS促进乳腺癌细胞侵袭的机制之一，但具体作用机制还需进一步探究。

综上所述，本研究证实cGAS高表达可促进乳腺癌细胞EMT进程，进而促进乳腺癌MCF7的增殖和迁移能力，揭示cGAS与细胞增殖、迁移相关。在后续研究中，我们将深入探讨cGAS-STING通路对肿瘤发生发展的影响及机制，为临床乳腺癌靶向治疗提供理论依据。