黄芪注射液对缺血性心肌病大鼠心肌自噬及心肌重塑的影响*

邵立群，白婷婷，赵 强，王春贵，宣丽颖，王 羽△，赵 明△

(1.内蒙古民族大学附属医院，2.内蒙古民族大学医学院，通辽 028000)

缺血性心肌病是慢性冠脉疾病类型之一，主要表现为心室扩大及心力衰竭[1]，其主要原因是由于长期冠脉缺血导致心肌细胞死亡及纤维组织增生等病理改变引发的心肌重塑。目前认为，在细胞死亡类型中除了坏死和凋亡外，还存在一种Ⅱ型程序性死亡，即自噬。自噬在心脏疾病发展中具有双重作用，在一些情况下，自噬可以降解损伤的细胞器，提供氨基酸及游离脂肪酸，对心肌细胞具有保护作用，但过度激活却对心肌产生损伤[2]。微管相关蛋白1轻链3(microtubules associated protein 1 light chain 3, LC3)是哺乳动物细胞中酵母Atg8基因的同源物，定位于前自噬小体和自噬小体膜表面，是细胞自噬小体膜的通用标记物。LC3首先在胞浆中合成并经过加工成可溶性的LC3I，经泛素化后，与自噬小体膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)结合形成LC3II。研究发现，在心肌缺血时心肌细胞的损伤与自噬具有相关性[3]。正常心肌细胞存在低水平自噬，但在缺血、缺氧等情况下，自噬水平升高[4]。

网腔钙结合蛋白(calumenin)是一种位于哺乳动物心肌细胞内质网/肌浆网内属于CREC家族具有多个EF-hand结构的钙离子(Ca2+)结合蛋白，与雷诺定受体2(ryanodine receptor2，RyR2)通道及Ca2+-ATPase(sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase，SERCA2a)相互作用调节心肌细胞钙释放，钙回摄与储存，共同维持钙循环稳态[5]。实验室前期研究发现，calumenin蛋白保护心肌细胞，但具体机制尚不明确。

黄芪是我国传统补气中药，始于《神农本草经》。随着现代药学工艺发展，传统中药在剂型上发展迅速，黄芪注射液为黄芪的一种剂型，其在临床上治疗心血管疾病效果显著。黄芪注射液通过抑制磷酸二酯酶活性，消除氧自由基，进而改善心衰患者心功能，减轻患者临床症状和体征[6]。本团队前期工作发现，黄芪注射液可有效改善阿霉素心肌病大鼠心脏功能，但对缺血性心肌病作用尚不清楚，本实验目的明确黄芪注射液对缺血性心肌病心脏功能的作用及作用产生机制，为临床应用提供实验资料。

1 材料与方法

1.1 动物药品与仪器

36只体重180～220 g雄性SD大鼠，购自吉林大学基础医学院动物中心，许可证号：SCXKs(吉)2011-0004。黄芪注射液(成都地奥九泓制药厂)，国药准字Z51021776，规格: 每支10 ml, 黄芪注射液的规格为每支10 ml含原药材20 g 每ml含黄芪原药2 g。麻醉药品氨基甲酸乙酯购买自天津百伦斯生物技术有限公司。calumenin抗体，LC3-I抗体、LC3-II抗体购自Boster公司，内参β-actin及GAPDH购自wanleibio公司；BL-420生物机能实验系统购自成都泰盟软件有限公司。光学显微镜(Olympus)和H-600型电子显微镜(日立，日本)。

1.2 缺血性心肌病大鼠模型的制备及分组

选体重180～220 g清洁级雄性大鼠36只，随机分为正常对照组、缺血性心肌病组、黄芪注射液组。正常对照组不进行任何处理。缺血性心肌病组和黄芪注射液组大鼠用20%的氨基甲酸乙酯(5 mg/kg)腹腔注射麻醉后，切开颈部皮肤并分离气管，做气管插管与人工呼吸机相连，按肢体标准Ⅱ导连接BL420生理仪记录心电图。沿胸骨左缘第二，三肋间隙迅速打开心包，暴露心脏，用0/3号缝合线从左心耳下缘1 mm 处进针，于肺动脉圆锥左缘出针，将心脏复位，结扎冠状动脉前降支，关闭胸腔，观察心电图变化，以心电图ST段抬高、T波高尖作为模型成功的标志，缺血20 min后，迅速打开胸腔，解开结扎线行再灌注，关胸并记录心电图变化。以R波消失，ST段弓背抬高，解开结扎线行再灌注后，ST段回落大于50%，为模型制备成功。手术结束关闭及缝合胸腔，关闭呼吸机拔出气管插管缝合气管创口及颈部皮肤，模型建立成功后。黄芪注射液组每次注射黄芪注射液10 g/kg 体重，每周注射1次，每次注射容积为1 ml，共注射4次；模型组给予相同容积的生理盐水注射。

1.3 心脏彩超检测

实验开始第4周，各组大鼠腹腔注射2%戊巴比妥进行麻醉，行心脏超声检查心脏结构变化相关指标舒张期室间隔厚度(diastolic interventricular septal thickness, iVSD)及心脏功能相关指标射血分数(ejection fraction, EF)。

1.4 病理取材及切片制作

第4周心脏彩超检查后，立即处死大鼠，在无菌状态下剪开大鼠左肋，去除心包后暴露心脏，取出心脏，将左心室肌组织放入4%多聚甲醛溶液固定，经乙醇脱水，石蜡包埋，切片，将心肌切片脱蜡、二甲苯透明，行HE、VG染色，于光镜下观察病理变化。同时取左心室组织放入4%戊二醛溶液固定，准备行电镜观测超微组织变化。

1.5 Western blot检测各组大鼠心肌组织中calumenin、LC3-I、LC3-II表达

各组大鼠心肌细胞提取蛋白质，采用Western blot方法检测各组大鼠心肌组织中calumenin与自噬相关蛋白LC3-I、LC3-II表达。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 缺血性心肌病大鼠模型心电图变化(图1)

结扎冠状动脉后大鼠心电图变化，R波消失，ST段弓背抬高，而解开结扎线行再灌注后，ST段回落大于50%，出现明显再灌注心律失常(图1)。结果表明，缺血性心肌病大鼠模型造模成功。

Fig. 1 Changes of electrocardiogram in rat model of ischemic cardiomyopathy

2.2 黄芪注射液对缺血性心肌病大鼠射血分数及心室内径的影响

与对照组及假手术组比较，缺血性心肌病组大鼠手术后4周心脏超声检查心室扩大，EF值降低，而给予黄芪注射液4周后的大鼠心脏超声检查心脏结构及功能与对照组无明显改变(图2，表1)。

Fig. 2 Comparison of echocardiographic results of rats in each group

Tab. 1 Changes of EF and Ivsd in different n=12)

2.3 光镜下观察各组大鼠心肌组织的变化

HE染色显示：与对照组大鼠比较，缺血性心肌病大鼠出现心肌纤维排列紊乱，心肌间质水肿；同时给予黄芪注射液的大鼠心脏心肌纤维紊乱，水肿现象有所缓解。VG染色显示：与对照组大鼠比较，缺血性心肌病大鼠心肌纤维明显增生，同时给予黄芪注射液的大鼠心肌纤维化降低(图3)。

Fig. 3 Histopathological changes of myocardium in rats of each group under light microscopy

2.4 电镜观察心肌组织超微结构改变

对照组大鼠心肌电镜下肌节完整，线粒体清晰，心肌纤维排列整齐，缺血性心肌病大鼠线粒体空泡化严重，心肌纤维排列紊乱，肌节完整性受损，黄芪注射液组大鼠心肌组织电镜下观察发现，少许线粒体空泡，心肌纤维排列尚整齐(图4)。

Fig. 4 Ultrastructural changes of myocardium in rats of each group under electron microscopy

2.5 Western blot检测各组大鼠心肌组织中calumenin、LC3-I、LC3-II表达变化

与对照组比较，缺血性心肌病组大鼠心肌细胞calumenin表达减少，LC3-II/LC3-I比值表达明显增加(P<0.01)，与缺血性心肌病组大鼠比较，黄芪注射液组大鼠心肌细calumenin表达增加，LC3-II/LC3-I比值表达降低(P<0.01，图5，表2)。

Fig. 5 The expressions of LC3-II/LC3-I and calumenin in different group

Tab. 2 The expressions of LC3-II/LC3-I and Calumenin by Western blot in different groups(n=3)

3 讨论

心肌缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，I/RI)发生时，易引发心功能障碍，血流动力学指数异常，研究认为，细胞凋亡参与心肌IRI损伤的病理过程，心肌缺血和再灌注均可引起心肌细胞凋亡，I/RI中，细胞自噬和细胞凋亡存在着复杂的相互作用[7]。本团队前期研究发现缺血性心肌病大鼠心肌细胞自噬相关蛋白LC3I、LC3II、BeclinI及LC3II/LC3I比值增加[8]，并且，calumenin表达减少可引发心肌细胞钙超载导致内质网应激，并通过内质网应激凋亡信号通路使细胞凋亡增加[9，10]。LC3是自噬形成中重要的一个组分，LC3结合系统的目的是进行磷脂化。LC3蛋白在细胞中存在两种剪切形式LC3-I和LC3-II。本研究发现，缺血性心肌病大鼠有明显的心肌重塑，同时存在心肌细胞calumenin表达减少，细胞自噬增加，LC3-I/LC3-II比值表达明显增加。分析其原因，可能是由于心肌细胞缺血、缺氧后线粒体受损，影响心肌细胞氧化磷酸化，ATP产生减少，进而引发calumenin表达减少，心肌细胞发生钙超载，引发心肌细胞内质网应激并通过内质网应激凋亡信号通路使心肌细胞凋亡增加。凋亡使工作心肌细胞绝对数量减少，而导致心肌收缩力下降，出现心力衰竭。中医认为，正常的心脏功能依靠气来推动，心主行血，这是中医学最基本的观点。而黄芪是我国传统中药之一，为补气要药，具有“益气固表，扶正祛邪”之功效。在本实验中发现，黄芪注射液可增加缺血性心肌病大鼠心肌细胞calumenin表达，进而减轻心肌细胞钙超载，抑制缺血性心肌病大鼠心肌重塑及细胞自噬；LC3-I/LC3-II比值表达降低，改善缺血性心肌病大鼠心脏功能。上述实验结果部分明确传统中药黄芪“补气”作用机制，至于心肌细胞缺血缺氧引发calumenin表达减少并导致心肌细胞钙超载具体机制，还有待以后进一步研究。