26种中草药提取物对鸡源多杀性巴氏杆菌的体外抑菌试验

王方雨，李 宁，孙雪峰，曹 帅，赵雅丽

(1.河南农业科学院动物免疫学重点实验室，河南 郑州450002；2.河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州450002）

鸡巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的传染病，是我国禽类养殖业中重要的传染病之一，多杀性巴氏杆菌也是人兽共患传染病病原菌[1,2]。该病一般发生在季节交替的时节，鸡巴氏杆菌病可引起鸡体温升高，精神萎靡，引起败血症，发病1～3 天内即可出现死亡，但整体致死率低，一般为为1%～10%。多杀性巴氏杆菌分为5 个血清型，广泛分布，发病情况与鸡的抗病能力和多杀性巴氏杆菌的毒力有关[3]。

巴氏杆菌病的治疗以抗生素为主，但随着抗生素的广泛甚至过度使用，出现了抗生素药效下降的现象，病原菌逐渐对抗生素产生耐药性。抗生素残留在动物体内，并部分排出环境中，对人类的食品安全和健康安全产生了威胁。随着人们对抗生素认识的提高，形成了减少抗生素使用的共识，在此背景下，研究者加大了对中药治疗细菌性疾病的研究。中草药具有不易产生耐药性、残留低、价格便宜等优点[4]，中草药用于畜禽疾病治疗的研究和实践越来越多。本试验研究了26种中草药体外对鸡源多杀性巴氏杆菌的最小抑菌浓度、最低杀菌浓度和敏感性等，期望筛选出对多杀性巴氏杆菌抑菌/杀菌强、耐药性低的中草药，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物

连翘、蒲公英、板蓝根、金银花、黄芩、黄连、黄柏、党参、白术、黄芪、赤石脂、柴胡、石榴皮、穿心莲、菊花、防风、地锦草、马齿苋、仙鹤草、白头翁、吴茱萸、龙胆草、大黄、鱼腥草、独活、地丁，购自河南省禹州市中药材批发行，所有药物经检定均符合生药质量标准。

1.1.2 菌种

多杀性巴氏杆菌（鸡源，CVCC1674），由中国兽医微生物菌种保藏管理中心提供。

1.1.3 主要试剂

氯化钠为分析纯，蛋白胨、牛肉浸膏和琼脂等均为生化试剂。麦氏比浊管（广东环凯微生物科技有限公司）。

1.1.4 主要仪器

恒温培养箱、电子天平、振荡培养箱、电炉、旋转蒸发仪、移液枪、中药粉碎机、高压灭菌锅、生物安全柜。

1.1.5 培养基

（1）普通肉汤培养基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，加纯化水至1000 ml，pH 7.2～7.4，121 ℃灭菌15 min。

（2）普通营养琼脂培养基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，加纯化水至1000 ml，pH 7.2～7.4，121 ℃灭菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 26种中草药提取物的制备

精密称取每味中药各100 g，加8 倍量蒸馏水煎煮，沸腾后改用文火煎1 h，期间始终保持8倍量水，用4 层纱布过滤，残渣加6 倍量水同法煎煮1 h 后过滤，合并两次滤液，减压浓缩至100 ml，使其浓度为1 g/ml。

1.2.2 多杀性巴氏杆菌菌液的制备

挑取普通营养琼脂平板上形态相同的菌落至少4～5 个，接种至5 ml 普通肉汤培养基中。37 ℃培养至菌液浓度达到或超过0.5 麦氏比浊管浓度，菌液浓度约为1～2×108 CFU/ml。用空白普通肉汤培养基校正菌液浓度，调至与0.5 麦氏比浊管相同，得0.5 麦氏多杀性巴氏杆菌菌液。

1.2.3 最小抑菌浓度（MIC）的测定

采用试管二倍稀释法测定药液对供试菌的MIC。（1）取无菌试管11 支，每管加入普通肉汤培养基2.0 ml；第1 管中加入受试药液2.0 ml，混匀后吸取2.0 ml 至第2 管中，依次作2 倍梯度稀释，直至第9 管取出2.0 ml 弃去；第10 管不加药液，作为阳性对照；第11 管加受试药液2.0 ml，混匀后取出2.0 ml 弃去，不加菌液，作为阴性对照，各管平行3 份。（2）用普通肉汤培养基将0.5 麦氏多杀性巴氏杆菌菌液稀释100 倍制成细菌稀释液，取细菌稀释液0.1 ml 分别加入上述1～10 管中混匀，11 号管加0.1 ml 灭菌生理盐水，各管置37℃培养18～24 h，观察结果。

1.2.4 最小杀菌浓度（MBC）的测定

取MIC 终点浓度以上未生长细菌的各稀释管内培养物0.1 ml，接种于琼脂平板培养基上，37℃培养18～24 h，观察有无细菌生长，培养基中无细菌生长的最低浓度即为受试药液的最低杀菌浓度。

1.2.5 药物敏感试验

采用管碟法对药物的敏感性进行试验。将普通营养琼脂培养基倾入灭菌培养皿内，放置凝固，用作底层培养基。吸取菌液0.1 ml 接种至底层培养基上，用涂棒将菌液涂匀，在平皿底部作好相应标记，用无菌镊子在每个平皿中等距离放置3 个牛津杯，用滴管分别将1g/ml 药液加到牛津杯中，以滴满为度，盖上平皿盖。然后将滴加药液的平皿水平置恒温箱内，37℃培养18～24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

判定标准：抑菌直径＜8 mm，为不敏感（耐药）；抑菌直径8～13 mm 之间，为低度敏感；抑菌直径在13～19 mm 之间，为中度敏感；抑菌直径＞19 mm，为高度敏感。

2 结果与分析

2.1 26 种中药提取物对多杀性巴氏杆菌的MIC和MBC 值

表1-1 体外最低抑菌浓度和最低杀菌浓度试验结果

由表1-1 可以看出，除党参外，其它25 种中草药提取物均对多杀性巴氏杆菌有一定的抑菌效果或杀菌效果。其中黄连的抑菌效果最好，MIC值为15.6 mg/ml，地丁的杀菌效果最好，MBC 值为31.3 mg/ml；在体外抑菌方面，抑菌效果较好的中草药分别为黄连、地丁、黄芪、石榴皮和连翘，杀菌效果较好的中草药分别为地丁和黄连，MBC 分别为31.3 mg/ml 和62.5 mg/ml。党参的体外抑菌和杀菌效果均较差，MIC 和MBC 值均超过了500 mg/ml。赤石脂和吴茱萸的抑菌和杀菌效果均较差，MIC 和MBC 值＞500 mg/ml。地锦草的杀菌效果较差，MBC 值＞500 mg/ml。

2.2 管碟法测定26 种中药提取物对多杀性巴氏杆菌的药敏试验结果

表1-2 药敏试验结果

从表1-2 可以看出，多杀性巴氏杆菌对各中草药提取物的敏感性不同，其中对黄连的敏感性最强，抑菌圈直径达26.17mm；多杀性巴氏杆菌对地丁、石榴皮、连翘等中草药提取物高度敏感，抑菌圈直径分别达到了23.22 mm、20.37 mm、19.53mm。多杀性巴氏杆菌对党参、赤石脂、吴茱萸、地锦草、独活等中草药提取物有耐药性。

3 结论与讨论

3.1 各中药体外抑菌试验方法的选择

关于中药体外抑菌活性的测定方法很多，一般采用的方法有固体培养基法、纸片抑菌法、平皿稀释法、平板打孔扩散法等，本试验采用试管二倍稀释法和管碟法相结合对各中药抑菌活性进行研究，在试管二倍稀释法试验过程中由于需要将中药提取液调制成弱碱性，加入了一定量的碱液，考虑到这有可能对试验结果造成影响，选用管碟法同时进行，方便对两种测定方法的结果进行对比，本研究结果显示，这两种方法具有紧密的相关性。

3.2 中药对多杀性巴氏杆菌的抑菌效果存在差异

本研究选用连翘、蒲公英、黄连、白头翁等26种中药对多杀性巴氏杆菌进行体外抑菌试验，结果表明各中药对多杀性巴氏杆菌均有一定的抑制作用，但不同中药的抑菌效果不同。其中黄连、地丁、石榴皮、连翘等具有很强的抑菌作用，而党参、赤石脂、吴茱萸、地锦草等对鸡源多杀性巴氏杆菌的抑菌/杀菌效果较差，多杀性巴氏杆菌对其不敏感或产生耐药性。本试验研究结果与相关报道不尽相同[5,6]，可能跟中药来源、产地、提取方式、病原菌血清型等有关。

曲径等[7]研究显示黄连、黄柏、地榆和艾叶为相加、协同作用。李达怡等[1]研究显示黄连与四制艾叶联合具有协同作用，优于两种单药各自的抑菌活性。以上研究表明多种中草药联合抑菌的效果优于单味中药的抑菌效果，为本试验以后的研究提供了新的思路。