特应性皮炎患者血清Linc00324和Th17细胞因子的表达及意义

运蓓蕾， 林 伟， 刘 悦

(辽宁省沈阳市第七人民医院皮肤科， 辽宁 沈阳 110003)

特应性皮炎是一种常见的慢性炎症性皮肤病，临床以周期性干燥、发红、发痒的皮肤病变为特征，病原学以有缺陷的皮肤屏障、反复感染以及局部和全身性免疫反应为特征，并常伴有过敏性鼻炎或哮喘[1,2]。该疾病常见于儿童中。在发达国家，儿童期的患病率约为20%，而在发展中国家，尤其是在城市化地区，患病率正在上升[3]。然而，由于特应性皮炎的发病机制比较复杂，目前对其病因和发病机制尚未完全明确。长链非编码RNA 00324(Long non-coding RNA 00324，Linc00324)是一个逆转录本长度大于200nt的非编码RNA，研究表明其在不同疾病的发生、发展中发挥重要作用，如Linc00324的表达量可作为诊断和评估系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的辅助指标[4]。研究发现，Linc00324的表达量与CD4+细胞计数呈正相关。Th17细胞是CD4+细胞的成员之一，在特应性炎症等疾病中起重要作用，其中Th17细胞主要通过细胞因子白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)调控免疫[5]。然而，目前有关Linc00324和Th17细胞因子与特应性皮炎的发病关系尚不清楚。基于此，本研究拟通过检测特应性皮炎患者血清Linc00324和Th17细胞因子IL-4、IL-10的表达情况，探究其在特应性皮炎发病中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料:选择2017年10月至2019年11月在本院经病理确诊的80例特应性皮炎患者为研究对象，分为特应性皮炎轻度组26例，其中男16例，女10例，年龄1～45岁，平均年龄(22.38±3.32)岁，平均体质量指数(Body Mass Index，BMI)为(22.02±2.46)kg/m2；特应性皮炎中度组24例，其中男11例，女13例，年龄1～48岁，平均年龄(22.92±1.61)岁，平均BMI为(22.89±2.75)kg/m2；特应性皮炎重度组30例，其中男16例，女14例，年龄1～50岁，平均年龄(22.09±2.53)岁，平均BMI为(22.12±2.81)kg/m2。同时选取35例健康人群作为对照组，其中男19例，女16例，年龄1～55岁，平均年龄(22.16±1.76)岁，平均BMI为(21.43±2.91)kg/m2。各组研究对象的性别及年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准通过，所有样品采集均取得受试者及其家属知情并签署同意书。特应性皮炎患者纳入标准：①符合中华医学会皮肤性病学分会免疫学组编制的《中国特应性皮炎诊疗指南》所推荐的诊断标准[6]；②患者及家属选择在本院接受治疗者；③1～50岁的患者。排除标准：①临床资料不全者；②免疫功能异常者；③同时患有可能干扰实验结果评估疾病者(如严重内分泌、血液系统疾病者)。特应性皮炎分度标准：按照《中国特应性皮炎诊疗指南》规定的诊断标准[6]，①轻度：皮疹面积小于5%；②中度：皮疹面积为5%～10%，或皮疹反复发作；③重度：皮损超过10%体表面积，或皮炎呈持续性，瘙痒剧烈影响睡眠。

1.2主要试剂与仪器:RNA提取试剂盒(货号：ml284600)、逆转录试剂盒(货号：ml7014)均购自上海酶联生物公司；实时荧光定量PCR检测试剂盒(货号：SF-1309)购自碧云天生物技术研究所；实时荧光定量PCR仪(型号：7500)购自美国Applied Biosystems公司；白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)(货号：FK-S0197)、白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)(货号：FK-S0176)ELISA试剂盒购自上海远慕生物科技有限公司；本研究中其他大部分化学药品均购自上海晶诺生物科技有限公司。

1.3研究方法

1.3.1样品采集及保存:清晨采集各组研究对象空腹静脉血(5mL/人)，离心后收集血清，置于-20℃保存待测。

1.3.2实时荧光定量PCR法(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测血清Linc00324水平:取出血清，使用RNA提取试剂盒提取总RNA，经逆转录得到cDNA。以cDNA为模板进行qRT-PCR检测。PCR反应体系共20μL，上下游引物各0.5μL。PCR反应条件：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s，共40个循环。血清Linc00324及内参GAPDH的上下游引物序列见表1。采用2-△△CT法计算血清Linc00324相对表达量。引物由宝日医生物技术(北京)有限公司合成。

表1 引物序列

1.3.3Th17细胞因子的检测:采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测Th17细胞因子IL-4、IL-10水平。具体步骤为：用包被缓冲液稀释抗体，加至96孔板包被，放置4℃冰箱过夜。用洗涤液洗板3次，加封闭液室温孵育1h。再次洗板后加血清样品，温室孵育2h。洗涤后加入HRP标记的亲和素，温室孵育1h。洗涤后加入底物，反应20min，再加入硫酸后停止反应。

2 结 果

表2 各组研究对象血清中Linc00324表达水平

2.1血清Linc00324在特应性皮炎及正常对照组中表达水平:特应性皮炎轻度组、中度组和重度组血清Linc00324水平显著高于对照组(P<0.05)；中度组和重度组血清Linc00324水平显著高于轻度组(P<0.05)；重度组血清Linc00324水平显著高于中度组(P<0.05)，见表2。

2.2Th17细胞因子在特应性皮炎及正常对照组中水平的变化:特应性皮炎轻度组、中度组和重度组Th17细胞因子IL-4、IL-10水平显著高于对照组(P<0.05)；中度组和重度组Th17细胞因子IL-4、IL-10水平显著高于轻度组(P<0.05)；重度组Th17细胞因子IL-4、IL-10水平显著高于中度组(P<0.05)，见表3。

表3 各组研究对象Th17细胞因子水平的变化

2.3血清Linc00324与Th17细胞相关性分析:根据Pearson相关分析结果显示，特应性皮炎患者血清Linc00324表达水平与Th17细胞因子IL-4、IL-10水平呈明显正相关(r=0.516、r=0.498，P<0.05)，详见图1和图2。

图1 特应性皮炎患者血清Linc00324、IL-4相关性分析

图2 特应性皮炎患者血清Linc00324、IL-10相关性分析

3 讨 论

特应性皮炎是一种基于皮肤屏障功能障碍的慢性炎症性皮肤疾病，与遗传、环境因素以及免疫系统的多种变化，共同导致弯曲褶皱处的湿疹和瘙痒性皮肤病变以及其他典型表现[7]。特应性皮炎的触发因素多种多样，并且涉及的病理生理网络非常复杂，近年来其发病率明显上升。特应性皮炎的发生、发展不仅给患者造成很大的经济负担，还严重影响患者的生活。目前，特应性皮炎的病因及具体的发病机制尚不完全清楚，因此，对特应性皮炎的发病机理的深入了解及研究是十分必要的。

长链非编码RNAs(long non-coding RNA, lncRNAs)是人类基因组中本身不被翻译为蛋白质的基因转录本，结构与mRNA类似，其长度大于200 nt。许多研究已证实lncRNA参与多种生物学机制，调控基因表达，对多种癌症及其它疾病的发生具有重要作用，且对获得性免疫疾病具有一定影响[8]。Linc00324又可称为C17orf44，是最新发现的一个长度为3341bp的lncRNA，位于14q13.1号染色体上[9]。近几年，随着人们对免疫学层面的深入研究，发现Linc00324可参与免疫调控，在自身免疫疾病发生及发展中起重要作用。鲍卫等研究发现[10]，Linc00324在类风湿关节炎中的表达明显上调，推测与类风湿关节炎的发生相关；在系统性红斑狼疮中的表达明显上调，推测Linc00324与系统性红斑狼疮疾病的发生相关。本研究发现特应性皮炎患者血清Linc00324水平显著高于对照组，提示血清Linc00324可能参与特应性皮炎的发生。本研究中重度组、中度组特应性皮炎患者血清Linc00324表达水平显著高于轻度组，重度组特应性皮炎患者血清Linc00324表达水平显著高于中度组，提示Linc00324参与特应性皮炎的发展进程。

Th17细胞是人们近几年发现的CD4+T细胞的一个亚群，其在自身免疫疾病及多种炎症反应中发挥重要作用。Th17细胞主要通过分泌细胞因子(如IL-4、IL-10和IL-17等)发挥其功能[11]。有研究发现，Th17细胞及细胞因子与慢性炎症性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等的发病有关[12]。随着对Th17细胞研究的加深，发现Th17细胞及细胞因子还与特应性皮炎的发生关系密切。本研究发现特应性皮炎患者Th17细胞因子IL-4、IL-10水平均显著高于对照组，提示Th17细胞因子IL-4、IL-10可能参与特应性皮炎的发生。本研究中重度组、中度组特应性皮炎患者Th17细胞因子IL-4、IL-10水平均显著高于轻度组特应性皮炎患者，重度组特应性皮炎患者Th17细胞因子IL-4、IL-10水平均显著高于中度组特应性皮炎患者，提示Th17细胞因子IL-4、IL-10参与特应性皮炎的发展进程。且特应性皮炎患者血清Linc00324与Th17细胞因子IL-4、IL-10水平均呈明显正相关，提示两者可能通过某种机制参与调控特应性皮炎的发生及发展。

综上所述，本研究结果显示，Linc00324和Th17细胞因子IL-4、IL-10在特应性皮炎患者血清中高表达，并参与特应性皮炎的发生及发展，可作为特应性皮炎的早期诊断及病情评估的生物学指标，具有重要的临床意义。但对其具体的作用机制尚未完全清晰，有待深入研究。