周期素依赖性激酶10在口腔鳞癌中的表达及其临床意义

刘倩峰 庞 超 杨佩璇 李庆星 牛英豪

口腔鳞状细胞癌（口腔鳞癌）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，转移和放化疗耐受是口腔鳞癌致死的主要原因[1，2]。因此，阐明口腔鳞癌细胞转移和放化疗耐受的分子调控机制将为设计诊断用生物标志物、验证药物治疗的分子靶点和明确切实有效的处理方案奠定实验基础。作为细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）家族成员之一，细胞周期素依赖性激酶10 在多种癌症中起到关键的调控作用，CDK10 表达缺失造成肿瘤细胞出现恶性生长并出现转移[3，4]。本研究应用免疫组织化学法检测在口腔鳞癌组织中CDK10 蛋白的表达状态，研究CDK10 表达与临床病理参数和生存期之间的相关性。

资料和方法

1.临床样本：收集在20011 年11 月至2012 年12 月收治的原发口腔鳞癌组织手术标本208 例，整理临床病理资料并进行电话回访。患者年龄最大71岁，最小32 岁，中位年龄50.2 岁。根据美国癌症联合委员会肿瘤淋巴结转移（tumor node metastasis，TNM）标准（第六版）分期。入组标准：①样本均经病理组织学确诊；②临床病理和预后资料齐全；③术前未行放化疗和生物治疗。排除标准：合并有其它种类恶性肿瘤。

2.主要试剂：兔抗人多克隆抗体（CDK10、P53 和Ki67）购自美国Santa Cruz 公司，EnVision 通用性试剂盒购自上海长岛生物技术有限公司，DAB 试剂购自中山金桥生物技术有限公司。

3. 免疫组织化学染色：用4%中性甲醛固定样本，石蜡包埋后4μm 厚度切片，二甲苯逐级脱蜡，梯度乙醇回水；3% H2O2溶液灭活内源性过氧化物酶；采用10mmol/L EDTA（pH 9.0）微波抗原修复；一抗（1:200 稀释）4℃过夜；按EnVision 二步法说明书进行染色，DAB 显色10min，苏木素复染2min，盐酸乙醇分化；脱水，透明后封固。PBS 替代一抗作为空白对照。

4. 免疫组化染色判定：CDK10 表达状态判定标准如下[5]：以细胞核出现明显的黄色至棕黄色颗粒为阳性信号。采用染色强度和阳性细胞数记分乘积的计算规则。免疫组化染色强度判断方法：0 分为没有着色，1 分为浅黄色，2 分为棕黄色，3 分为棕褐色。高倍镜下（×400）选择10 个视野计算癌细胞的阳性染色百分率：0 分为无染色，1 分为1%～25%细胞2 分为6%～50%染色，3 分为51%～75%，4 分为76%～100%。染色强度分数与阳性细胞百分率记分乘积为最终评分，低表达为1～3 分，阳性染色定义为为≥4 分。P53 和Ki67 表达状态判定：细胞核无着色为0 分、1 分为＜1%细胞染色、2 分为1%～10%、3 分为11%～33%细胞染色、4 分为34%～66%细胞染色、5 分为≥67%细胞染色，染色强度按无、弱、中、强分别评为0、1、2、3 分。二者之和，≤2 分为染色阴性，＞2 分为染色阳性。

5.统计学方法：应用SPSS 17.0 统计软件，计数资料比较采用χ2检验，生存期分析采用Kaplan-Meier 法和log rank 检验。单因素分析和多因素分析采用COX 风险比例模型，确立影响患者的独立预后因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.CDK10 蛋白表达与患者临床病理参数的联系：口腔鳞癌组织中CDK10 蛋白主要表达于肿瘤细胞的细胞核（图1）。在208 例临床样本中103 例为CDK10 为呈阴性表达（49.5%），105 例呈阳性表达（50.5%）。CDK10 表达在临床TNM 分期Ⅲ/Ⅳ高于Ⅰ/Ⅱ期期（P＝0.035），在淋巴结转移组（N1-N3）高于无淋巴结转移组（N0）（P＝0.042），在T3/T4 组高于T1/T2 组（P＝0.019）。CDK10 表达与患者年龄、组织学分级、P53 和Ki67 表达状态等临床病理参数无关（表1）。

2.CDK10 蛋白表达与患者预后的关系：应用Kaplan-Meier 法研究CDK10 表达与患者总生存期之间的关系发现，CDK10 在癌组织中阴性表达的患者总生存期显著高于CDK10 阳性表达的患者（P＝0.003）（图2）。

图1 口腔鳞癌组织中CDK10 蛋白阳性表达（EnVision×200）

表1 口腔鳞癌组织中CDK10 表达与患者临床病理参数的关系

3.CDK10 表达与口腔鳞癌预后参数的关系：COX 风险比例模型分析影响口腔鳞癌患者总生存期之间的因素。单因素分析显示，CDK10 表达（P＝0.004）、性别（P＝0.010）、组织学分级（P＜0.001）、临床TNM 分期（P＜0.001）、T 分期（P＜0.001）、N 分期（P＜0.001）、P53 表达（P＝0.027）与患者总生存期相关。多因素分析显示，组织学分级（P＝0.029）和临床TNM 分期（P＝0.070）是影响患者总生存期的独立因素。

图2 Kaplan-Meier 法分析CDK10 表达与患者总生存期的关系（P＝0.003）

表2 COX 风险比例模型单因素和多因素分析

讨 论

口腔鳞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈迅速上升，转移是导致病人死亡的最主要原因之一。人乳头瘤状病毒感染、吸烟均是提高口腔鳞癌的流行病学危险因素。不同的病理性因素导致的口腔鳞状上皮细胞的基因调控异常，包括细胞基因突变、DNA 错配修复和细胞周期改变，多种因素共同导致口腔鳞癌的发生发展。近年来研究口腔鳞癌发病和进展的分子机制成为预防和临床治疗口腔鳞癌的主要着眼点。细胞周期素依赖性激酶（CDK）与细胞周期性蛋白（cyclins）、细胞周期素依赖性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI）三者相互作用成为调控真核细胞周期的关键机制。CDK10 基因全长9.7Kb，含有13 个外显子，定位于人染色体16q24.3，编码360 个氨基酸，其蛋白分子量大约40kD[6～8]。CDK10 被证明是一类参与调节细胞周期并广泛表达于人体组织器官的丝/苏氨酸蛋白激酶，参与神经发育、肝脏纤维化、肿瘤发生发展等多种生理与病理过程。

研究发现依赖于雌激素受体（estrogen receptor）的存在，CDK10 基因失活诱导乳腺肿瘤细胞对选择性雌激素受体调节剂他莫西芬出现耐药[9，10]。在乳腺癌、肝癌和胆管癌中的研究中证实CDK10 在肿瘤组织和肿瘤细胞中表达水平减弱，与肿瘤淋巴结转移、临床分期和不良总生存期密切相关，可作为预后评估的独立因素[11～13]。最新研究表明，胃癌组织中CDK10 表达缺失同胃癌淋巴结转移、远处转移、临床分期、组织学分级和不良总生存期显著相关，多因素分析显示CDK10 表达可作为预后判断的独立因子[14]。此外，功能试验证实肝细胞癌中miR-3127-5p通过靶向抑制抑癌基因Cdk10 从而促进肝癌细胞侵袭及迁移[15]。在胶质瘤的一项研究中，CDK10 通过调节转录因子Snail 的表达而影响肿瘤细胞转移与侵袭[16]。后续研究明确了CDK10 与ETS2 相互作用的分子机制，即活化型CDK10（CDK10/cyclinM）磷酸化ETS2 使其被蛋白酶体识别并降解[17]。

本研究应用免疫组化研究发现CDK10 表达与口腔鳞癌淋巴结转移、临床分期、患者性别、组织学分级显著相关，提示CDK10 是参与口腔鳞癌发展的关键调节因子。结合随访资料进一步统计发现CDK10 表达高的口腔鳞癌患者总生存期时间减少。这些研究结果提示，CDK10 可能在口腔鳞癌进展中发挥类似于癌基因的作用，这同以往在其他类型肿瘤中的研究不同。CDK10 作为一种独特的细胞周期素依赖性激酶，在不同肿瘤发生发展过程中发挥的作用具有差异性，这可能和肿瘤组织来源和肿瘤细胞微环境的不同有关。扩大临床检测样本量、进行细胞与动物实验并深入分析其分子调控机制是探索CDK10 在口腔鳞癌中具体作用的研究方向。

此外，Ki67 作为一种与有丝分裂密切相关的刺激细胞增生相关核抗原因子，是重要的癌症诊断和生存期评估的分子参数[18～20]。但是本研究显示CDK10表达与Ki67 表达无显著相关，可能因为CDK10 调控的分子通路在不同种类肿瘤中表现差异。p53 是已发现的关键的肿瘤抑制基因，通过众多不同的细胞信号转导路径调节细胞正常细胞活动。此外，p53基因与细胞内其它信号调控因子的相关作用，能够通过其磷酸化、乙酰化及甲基化等修饰过程，提高癌细胞的错配修复能力，阻断DNA 的复制，促进细胞的发生凋亡。在人类超过半数的多种肿瘤组织中出现了异常的p53 基因突变，被认为是癌症发生过程中最重要的分子改变[21～23]。，由于p53 基因突变后其三维分子构象出现变化，丧失了其正常调控细胞生长、细胞凋亡和核酸修复的功能。本研究显示CDK10 表达与p53 表达无显著相关，提示CDK10作为一种独特的分子可能发挥复杂的调控作用。在对于CDK10 的研究中不能单独抽象地观察其基因调控的复杂作用，而是应该从全局整合其功能。

综上所述，CDK10 表达同口腔鳞癌临床病理特征和患者预后密切相关，可能是参与口腔鳞癌发展的遗传事件。阐明CDK10 表达与口腔鳞癌临床病理特定关系以及对患者生存期的，不仅有助于改善口腔鳞癌临床诊断的准确性，而且可以提供更为敏感高效的口腔鳞癌预后评价指标，指导个体化治疗方案医生的制定，从而改善口腔鳞癌的临床治疗现状。