单侧咀嚼对大鼠髁突软骨细胞中p53、Bcl-2及caspase-12表达的影响

程 洁 张 栋 李 娟 闫桂艳 谷建琦

颞颌关节紊乱病是口腔科临床的常见病、多发病，以关节弹响、疼痛、张口受限为主要临床症状。本研究造模大鼠单侧咀嚼模型，导致双侧髁突受力不均，髁突软骨发生生理性及病理性改建。终身具有改建能力是髁突软骨的重要生物学特征，因此短暂的咬合关系异常可能不会对颞颌关节造成实质性的破坏，但长期单侧咀嚼带来的受力不均则可能导致颞颌关节紊乱病的发生，造成颞颌关节系统不可逆的改变。本研究通过检测分析细胞凋亡通路中的关键蛋白，进一步探讨髁突软骨细胞的凋亡机制及相关蛋白的相互作用关系。

资料和方法

选取由河北医科大学动物中心提供的3 周龄雄性SD 大鼠（3 周龄，体重160g～190g）96 只，随机等量分为8 组，实验组及对照组各4 组，每组12 只。适应性饲养一周后，拔除左侧上、下颌所有磨牙，于拔牙后第1d、7d、14d、28d 取材。

动物造模及取材：实验组大鼠经10%水合氯醛4ml/kg 腹腔注射麻醉后，拔除左侧上、下颌所有磨牙，对照组不做任何处理。拔牙后第1d、7d、14d、28d，每组随机选取6 只，完整取出双侧髁突关节软骨，于多聚甲醛中固定。另外6 只，麻醉后直接取髁突软骨冻存于-80℃冰箱中。对照组大鼠与对应实验组同期处死并取材。

免疫组化染色：常规固定、包埋，将厚度4um 的组织切片脱蜡、入水后，3%甲醇双氧水，室温30 分钟，自来水洗，采用热修复方法之后放入PBS 中，然后进行划蜡；切片上滴加山羊血清封闭液，室温30分钟；滴加第一抗体，4℃过夜，次日拿出来后等10～20 分钟室温平衡后放入PBS 中；滴加生物素化第二抗体（IgG），37℃20 分钟，放入PBS 中；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃20分钟，放入PBS 中；DAB 显色；苏木素复染细胞核7～8S，脱水，二甲苯透明、中性树脂封片。显微镜下观察，使用美国Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus v 5.1 软件进行图像分析。

实时定量PCR（RT-PCR）检测：用Trizol 提取组织样本中总RNA。取5μlRNA 用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA 的完整性。用天根生物科技有限公司的TIANScript RT KIT 进行反转录为cDNA，实验操作按产品说明书进行。设计引物序列进行扩增，β-actin 用作内定参考。PCR 反应程序：95℃15min，95℃10s，58℃30s，72℃30s，循环40 次。分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60℃～95℃进行溶解曲线分析。

用荧光定量PCR 仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。根据RT-PCR 原始检测结果，按照2-△△ct相对定量计算公式，即：△△Ct＝[Ct目的基因（实验组）-CtBeta基因（实验组）]-[Ct目的基因（对照组）-CtBeta基因（对照组）]。计算出各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品目的基因mRNA 转录水平的差异。

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析，不同时间点实验组左、右侧及对照组之间的比较，各实验组内同侧不同时间点的数据分析均采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.免疫组化结果：镜下选取5 个视野，计算阳性细胞数及阳性细胞显色强度，从而得出免疫组化评分（IHS）的数值。caspase-12 在髁突软骨细胞中的DAB 显色为棕黄色，对照组阳性表达很少，阳性细胞主要位于肥大层（图1）。实验组左侧IHS 评分1d，7d，14d，28d 时均显著高于对照组（P＜0.05），阳性细胞分布于增殖层和肥大层；实验组右侧IHS 评分1d，7d，14d 时显著高于对照组（P＜0.05），28d 时与对照组无显著性差异（P＞0.05）。1d、7d、14d、28d组，实验组左侧IHS 评分逐渐升高，14d 较7d 组、28d 较14d 组升高有显著性差异（P＜0.05）；实验组右侧IHS 评分逐渐降低，在7d，28d 时降低较前一时间点有统计学差异（P＜0.05），28d 时与对照组无显著差异（P＞0.05）（图2）。

图1 对照组、实验组左侧及实验组右侧染色结果比较（免疫组化染色 ×400）

图2 不同时间IHS 评分对比

表1 对照组和实验组左、右侧p53 含量在不同时间段的变化

表2 对照组和实验组左、右侧Bcl-2 含量在不同时间段的变化

2.RT-PCR 结果：由于对照组p53 和Bcl-2 含量在不同时间点的左右侧对比均无统计学差异（P＞0.05），所以分别将不同时间点对照组的左、右侧合并为一组。拔牙后1d 时，实验组右侧p53 含量＞实验组左侧＞对照组，差异有统计学差异（P＜0.05）；Bcl-2 含量实验组左侧和右侧均高于对照组（P＜0.05），实验组左侧高于实验组右侧，但无统计学差异（P＞0.05）。拔牙后7d 时，实验组左、右侧均高于对照组（P＜0.05），实验组左侧高于实验组右侧，但无统计学差异（P＞0.05）；Bcl-2 含量实验组左侧和右侧均高于对照组（P＜0.05），实验组右侧高于实验组左侧（P＞0.05）。拔牙后14d 时，实验组左侧p53含量＞实验组右侧＞对照组，差异有统计学差异（P＜0.05）；Bcl-2 含量实验组右侧＞实验组左侧＞对照组，差异有统计学差异（P＜0.05）。拔牙后28d时，实验组左侧p53 含量明显高于实验组右侧和对照组（P＜0.05），实验组右侧与对照组无统计学差异；Bcl-2 含量实验组左侧明显低于实验组右侧和对照组（P＜0.05），实验组右侧与对照组无统计学差异。随时间延长纵向比较，实验组左侧p53 含量1d、7d、14d、28d 逐渐升高的趋势，14d 组较7d 组显著升高（P＜0.05），28d 组较14d 组显著升高（P＜0.05）；实验组右侧p53 含量逐渐降低的趋势，14d 组较7d组显著降低（P＜0.05），28d 组较14d 组显著降低（P＜0.05）。Bcl-2 在实验组左侧的表达逐渐降低，14d 组较7d 组显著降低（P＜0.05），28d 组较14d 组显著降低（P＜0.05）；Bcl-2 在实验组右侧的表达逐渐增强，14d 组较7d 组显著增强（P＜0.05），28d 组较14d 组显著增强（P＜0.05）。

讨 论

颞颌关节紊乱病以髁突的病理性改变为主要病理学特征，许多学者对各种外界刺激导致的髁突软骨的退行性改变做了大量研究[1～4]。本研究对单侧拔牙后，大鼠双侧髁突承受压力失衡导致的髁突软骨细胞的退行性改变进行相关凋亡通路中关键蛋白的检测，了解髁突软骨细胞的凋亡途径。

p53 蛋白主要分布于细胞核浆，由于p53 蛋白易降解，因此正常细胞中p53 的蛋白水平较低。p53可整合多种压力刺激信号并随之影响细胞[5]。氧化应激反应下，细胞DNA 受损时，p53 的表达上调，阻止DNA 复制，为DNA 修复创造条件，若DNA 修复失败，则引发细胞凋亡反应[12]。p53 蛋白受到多种调控因子的作用[6，7，11]。p53 通过激活其下游的p21 WAF1/CIP1 基因介导细胞凋亡。

Bcl-2（B-cell lymphoma-2），属膜整合蛋白，位于线粒体、内质网、连续的核周膜，有促进细胞存活，抑制细胞凋亡的作用[8]。Bcl-2 可阻止线粒体释放细胞色素C，发挥抗凋亡作用；而Bax 通过与线粒体上离子通道的相互作用可介导细胞色素C 的释放，促进凋亡[8，9]。p53 可通过增加Bax 的表达，降低Bcl-2的表达，共同完成促进细胞凋亡作用。p53 通过对Bcl-2 的基因转录抑制或蛋白修饰来拮抗Bcl-2 的功能，p53 也可直接抑制Bcl-2 的功能。也有研究表明p53 可与Bcl-2 直接结合，抑制Bcl-2 的功能[10]。

caspase-12 属于caspase 家族，是一类半胱氨酸蛋白酶，是内质网凋亡通路中的关键蛋白。细胞受到氧化应激反应后发生内质网应激，导致内质网发生蛋白错误折叠或未折叠蛋白增多，激活caspase-12，经过一系列的级联反应最终由caspase-3 执行细胞的凋亡反应。许多学者对caspase-12 在髁突软骨中的作用也做了大量研究，发现caspase-12 参与了髁突软骨细胞的内质网应激介导的凋亡反应[13～15]。

本实验结果显示实验组大鼠拔除左侧磨牙后，导致咬合关系的突然改变，进而致双侧髁突受力发生改变，髁突软骨细胞受到力学系统改变激发应激反应。左侧咀嚼压力突然降低，且拔牙后的炎症反应引起细胞DNA 损伤，RT-RCR 结果显示实验组左侧p53 的表达上调，较对照组增加有显著性差异，实验组右侧由于咀嚼压力的突然增大，也导致髁突软骨细胞中p53 含量增加明显。p53 的上调导致Bcl-2的表达下降，实验组左侧和右侧的软骨细胞中Bcl-2 含量逐渐降低。骤然增加的咀嚼压力导致髁突软骨细胞胞浆中的Ca+浓度增加，多余的Ca+被转运至线粒体或内质网，内质网的Ca+超载导致内质网发生超负荷反应，进而使caspase-12 增加。免疫化染色结果显示实验组左侧的caspase-12 逐渐增加，且14d 较7d 组、28d 较14d 组增加有显著性差异，这与RT-RCR 的结果一致，进一步验证了以上反应机制。组织学变化显示实验组右侧1d、7d、14d 组的免疫组化染色caspase-12 的HIS 评分增加，即肥大层的棕黄色染色细胞增加，说明p53 激活p21 WAF1/CIP1 进一步发生凋亡反应，内质网凋亡通路的关键蛋白caspase-12 表达增加，进一步激活caspase-9，最终由caspase-3 执行凋亡反应。随时间延长，右侧髁突对新的压力逐渐适应，实验组右侧caspase-12 的HIS 评分减少至与对照组无显著性差异，表明随着软骨细胞内DNA 修复的进行，右侧p53 逐渐下调，而抑制细胞凋亡的Bcl-2 表达逐渐增强，细胞凋亡被抑制，caspase-12 表达也逐渐降低，组织逐渐恢复正常，而左侧髁突缺乏正常的咀嚼压力刺激，发生废用性萎缩，实验组左侧的p53 含量逐渐增高，Bcl-2 受抑制呈下降趋势。可见单侧后牙缺失导致的双侧髁突软骨受力不平衡，初期双侧髁突软骨均出现病理性改变，诱导促凋亡蛋白表现出p53、caspase-12 表达增强，抗凋亡蛋白Bcl-2 含量降低，启动细胞凋亡反应，随时间延长，右侧髁突逐渐适应新的外力负荷，p53、caspase-12 表达下降，细胞增殖与凋亡反应逐渐恢复平衡。本研究采用了免疫组化和RT-PCR 两种检测方法，通过免疫组化，我们可以定位检测蛋白质，阳性的强弱表示量的多少，也就是它与配体或抗体的结合的量；RT-PCR 实质上是对mRNA 的扩增，可据此分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况，用作基因的定量测量，这两种检测方法结合，更加全面地分析了蛋白质的产生地和产生能力。