钩端螺旋体引起巨噬细胞炎症反应的研究

郭卉 董瑶佳 张启贵 曾令兵

摘要：目的  研究钩端螺旋体56601株、JDL03株和JDL10株刺激金黄地鼠腹腔巨噬细胞后炎症因子的表达情况。方法  分别采用钩端螺旋体56601株、JDL03株与JDL10株感染金黄地鼠腹腔巨噬细胞后，取上清，采用ELISA法检测3个细胞株中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平。结果  培养24 h后，感染56601株的金黄地鼠腹腔巨噬细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平高于感染JDL03株和JDL10株，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  钩端螺旋体56601株能在巨噬细胞中引起较强的炎症反应，而JDL03株和JDL10株引起的炎症反应较轻，可用于后期筛选疫苗靶标。

关键词：钩端螺旋体;巨噬细胞;炎症反应

中图分类号：S855                                  文献标识码：A                                   DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.20.016

文章编号：1006-1959（2020）20-0057-03

Study on Leptospira-induced Inflammation of Macrophages

GUO Hui1，DONG Yao-jia2，ZHANG Qi-gui1，ZENG Ling-bing3

（1.Department of Laboratory Medicine，the First People's Hospital of Jiujiang City，Jiujiang 332000，Jiangxi，China;

2.Department of Laboratory Medicine，Jiujiang Maternal and Child Health Hospital，Jiujiang 332000， Jiangxi，China;

3.the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，Jiangxi，China）

Abstract：Objective  To study the expression of inflammatory factors after Leptospira strain 56601， JDL03 strain and JDL10 strain stimulated the peritoneal macrophages of golden hamster.Methods  After infecting golden hamster peritoneal macrophages with Leptospira 56601， JDL03 and JDL10， the supernatant was taken and the expression of TNF-α， IL-1β and IL-6 in the three cell lines was detected by ELISA level.Results  After 24 h of culture， the expression levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in the peritoneal macrophages of golden hamster infected with 56601 were higher than those infected with JDL03 and JDL10，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion  The Leptospira 56601 strain could cause a strong inflammatory response in macrophages， while the JDL03 and JDL10 strains cause a milder inflammatory response， which could be used for later screening of vaccine targets.

Key words：Leptospira;Macrophages;Inflammation response

鉤端螺旋体（leptospira）简称钩体，菌体呈细长、螺旋状，可分为非致病性钩体（又称为腐生型钩体）和致病性钩体两大类[1]。生活在天然地表水和土壤中的腐生型钩体不会导致疾病，而包括问号钩端螺旋体在内的致病性钩体能引起人及动物的钩端螺旋体病[2，3]，简称钩体病，是一种全球性的人畜共患病，其在全世界各地都广泛流行，同时在我国绝大多数地区也都有不同程度的流行，尤以降水量充足的长江中下游地区最为严重，是我国重点防治的传染病之一[4]。钩体病的临床表现不尽相同，轻症患者可只表现为感冒样症状;而重症患者则可出现肝、肾、肺等多脏器的出血性病变，甚至死亡[5]。目前，在致病性钩体菌中已发现超过250种血清型，但对于钩端螺旋体一直都缺乏有效的遗传操作手段，导致钩体病的关键致病因子还未完全阐明，本文通过研究钩端螺旋体56601株[6]、JDL03株和JDL10株感染金黄地鼠巨噬细胞后产生的炎症反应的差异，旨在为进一步探究机体对控制钩体感染的作用机制及后期筛选疫苗靶标提供参考。

1材料与方法

1.1实验材料  问号钩体56601株、JDL03株和JDL10株由上海交通大学病原生物学教研室提供;EMJH培养基购自美国Sigma公司;酶联免疫吸附试验试剂盒如TNF alpha Human ELISA Kit试剂盒、IL-1βHuman ELISA Kit试剂盒和IL-6 Human ELISA Kit试剂盒均购自美国Thermofisher旗下eBioscience公司;主要仪器包括细胞培养箱、科华320全自动酶标仪等。

1.2实验细胞  实验细胞的提取：将清洁级金黄地鼠（小鼠6～8 周，雌性，购自上海生物制品所）脱颈椎处死，并浸入75%乙醇中10 s，取出小鼠并沥干，将其仰卧于不锈钢方盘上，用注射器吸6 ml生理盐水注入腹腔中，轻揉小鼠腹部2 min，使液体在腹腔内充分流动，用眼科镊提起小鼠下腹皮肤，使小鼠微倾向一侧，剪开腹部皮肤后在肌肉层剪开一个小口，用胶头滴管将腹腔液吸出转入离心管中。每只吸出量约4～5 ml。

1.3实验细胞的培养  在4 ℃条件下，将收集的清洁级金黄地鼠腹腔灌洗液以1000 r/min离心10 min，去上清液，加入高糖DMEM细胞培养液用细胞板计数。显微镜下计数巨噬细胞，调整细胞浓度至所需，接种至细胞培养瓶，37 ℃培养箱孵育4 h，充分贴壁后弃上清液，除去非粘附细胞再加入高糖DMEM细胞培养液，放回培养箱中培养备用[6]。

1.4方法  取钩端螺旋体56601株、JDL03株和JDL10株接种于EMJH培养基中[7]，28 ℃培养5～7 d后将处于对数生长期的钩体于室温下8000 r/min离心15 min，用无菌PBS液重悬后在暗视野显微镜下计数，调整细胞数量为1×108个/ml。雌性金黄地鼠腹腔注射1 ml 5%巯基乙酸钠溶液，5 d后提取小鼠腹腔巨噬细胞。将小鼠腹腔巨噬细胞1×105个接种于96孔板中，过夜培养[8]。将处于对数生长期的钩体以MOI=100：1感染细胞，同时另将无菌PBS液0.1 ml加入已接种小鼠腹腔巨噬细胞的96孔板中作为对照组，24 h后取上清，分别用ELISA试剂盒检测上清中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平[9]，所有操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行。

1.5统计学方法  所有研究数据均采用SPSS 25.0统计分析软件、GraphPad Prism 8统计分析和作图软件处理，计量数据采用（x±s）表示，行t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

钩端螺旋体56601株、JDL03株和JDL10株感染小鼠腹腔巨噬细胞24 h后TNF-α水平均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;且56601株感染巨噬细胞分泌的TNF-α高于JDL03株和JDL10株，差異有统计学意义（P<0.05）;各株螺旋体刺激巨噬细胞产生的IL-1β、IL-6水平高于对照组，且56601株诱导的IL-1β、IL-6水平高于JDL03株和JDL10株，差异均有统计学意义（P<0.05）;另外，DL03株和JDL10株感染小鼠腹腔巨噬细胞24 h后TNF-α、IL-1β和IL-6水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）;见表1、图1。

3讨论

钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体引起的威胁人类健康和畜牧业生产的常见人兽共患病。钩体病在77 个国家和地区已经有过报道，尤以水稻种植为主的广大发展中国家更为盛行。目前，钩体病每年约有500000 例的病例报道，致死率约10%。钩体病的临床症状可表现为轻重缓急不一;轻症患者可只表现为感冒样症状，而重者可出现肝、肾、肺等多脏器功能衰竭，甚至死亡。我国也是钩体病的高发地区之一，主要集中在降水量相对充足的长江中下游地区，如江西省、湖北省、四川省等省份[4]。自80年代后，我国钩体病的发病率虽然处于逐年下降的趋势，但是钩体病疫区常常随着洪水季节的到来而出现爆发疫点。世界卫生组（WHO）为此建立了一系列的钩体研究组织，对钩端螺旋体的致病机制、疫苗和诊断靶点的开发等进行更加深入的研究[10]。近年来关于钩体和钩体病的相关报道在逐年增加。然而，由于一系列技术上的局限性，钩体的研究一直缺乏一套行之有效的遗传操作手段;在其他致病菌中普遍的体内遗传操作，都难以在致病性钩体中实现，导致了钩体病的致病机制到目前为止还未完全阐明，从而阻碍了钩体病高效安全疫苗的开发和防治。

感染致病性钩端螺旋体的人表现出从无症状到严重或致命疾病的多种临床表现。尽管目前钩端螺旋体可以用分子生物学技术分为不同的种类，但用血清学方法分类仍然是常用的方法[11，12]。目前已报道的致病性血清型超过250种，不同血清型是否能引起不同程度的疾病仍存在疑问，钩端螺旋体引起不同程度症状的能力可能涉及多种因素，如生物体的毒性和数量以及宿主因素等。对于钩端螺旋体也一直都缺乏有效的遗传操作手段，导致钩体病因尚未完全阐明，其诊断和疫苗也缺乏有效的免疫靶标[11]。巨噬细胞能够参与机体的特异性和非特异性的免疫反应，当机体出现受损的组织或者细胞时，巨噬细胞能够分泌多种细胞因子[13，14]。目前已有许多不同钩端螺旋体毒株诱发巨噬细胞分泌细胞因子的相关研究[15]。

TNF-α是一种能够调节细胞生长、分化、诱发炎症并调控细胞凋亡的细胞因子，它是整个炎症反应过程中最早产生的诸多细胞因子之一，其主要由激活的单核细胞和巨噬细胞产生，它的产生可以诱导和促进B淋巴细胞和T淋巴细胞产生抗体，进而引起炎症反应。有许多的研究表明很多疾病的进展都和高水平的TNF-α生物活性相关[10]。IL-1β是一种由巨噬细胞产生的参与炎症反应的重要介质，它是诱发炎症反应的过程中一个主要环节，IL-1β有着极其重要的生物学功能，主要参与抗原呈递、细胞生长、炎性反应等过程。局部低浓度的IL-1β可以促进T细胞的活化，诱导B细胞的增殖和抗体分泌[16]。IL-6是一种能够广泛参与机体免疫反应的细胞因子，其主要由纤维母细胞、单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、角质细胞、以及多种瘤细胞所分泌产生，并且能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能[17]。本次研究结果显示，对照组以及钩端螺旋体56601株、JDL03株和JDL10株均能够刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β和IL-6，其中对照组产生的TNF-α、IL-1β和IL-6的水平较低;感染56601株的巨噬细胞产生的TNF-α、IL-1β和IL-6的水平高于感染JDL03株和JDL10株以及对照组的水平，差异有统计学意义（P<0.05）;而感染JDL03株和JDL10株的小鼠腹腔巨噬细胞所产生的TNF-α、IL-1β和IL-6的水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）;说明钩端螺旋体56601株的毒力强于JDL03株和JDL10株，而钩端螺旋体JDL03株与JDL10株之间的毒力差异不显著。此结果为研究钩端螺旋体56601株的表面暴露蛋白质组和后期筛选问号钩端螺旋体保守的表面抗原，并对其进行相应的保护性验证，以及为问号钩体免疫靶标的筛选[18]提供一定的依据。

综上所述，钩端螺旋体56601株能在巨噬细胞中引起较强的炎症反应，而JDL03株和JDL10株引起的炎症反应较轻，可用于后期筛选疫苗靶标。

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收稿日期：2020-05-26;修回日期：2020-06-08

编辑/钱洪飞