甲醇中五氯硝基苯溶液标准物质研制

高晶，徐蓓，汤桦，何海红

(中国计量科学研究院，北京 100029)

五氯硝基苯属于有机氯杀菌剂，主要作为土壤杀菌剂和搅拌剂广泛应用于大棚蔬菜病菌防治，大田种子病虫害预防［1–2］，以及一些功效植物如人参、黄芪、银杏等的种植中。研究表明，五氯硝基苯具有生物累积性，可导致肝、肾和神经系统的损伤，并引发各种特异性疾病，所以世界各国对五氯硝基苯的使用进行了限制，如瑞典、奥地利、德国等国家禁止使用该农药［3–6］，GB 2763–2019 《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》［7］和《中国药典》2015年版中均对五氯硝基苯在食品和中药材中的残留量进行了严格的限定。因此测定食品和环境样品中五氯硝基苯含量具有重要意义。

目前测定五氯硝基苯的方法主要依据GB／T 5009.136–2003 《植物性食品中五氯硝基苯残留量的测定》［8］和SN／T 1957–2007 《进出口中药材及其制品中五氯硝基苯残留量检测方法 气相色谱–质谱法等》［9］。标准物质作为量值传递溯源的载体，是获得有效结果的重要保证，但目前国内只有五氯硝基农药苯纯度标准物质，尚无使用便利的五氯硝基苯溶液标准物质。笔者以五氯硝基苯农药纯度标准物质为原料，采用重量–容量法制备了甲醇中五氯硝基苯溶液标准物质，该标准物质具有良好的均匀性和稳定性，可用于食品和环境样品中五氯硝基苯分析方法的确认和评价、仪器校准与检测质量控制，为五氯硝基苯分析量值的准确、可靠提供保障。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1100 型，美国安捷伦科技有限公司；

电子天平： XP26 型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒公司；

五氯硝基苯农药纯度标准物质：编号为GBW(E) 060617，纯度为99.5%，不确定度为0.3%，k=2)，中国计量科学研究院；

甲醇：HPLC 级，美国默克公司。

1.2 标准物质制备

以五氯硝基苯农药纯度标准物质和HPLC 级甲醇为原材料，于(20±2)℃条件下，采用重量–容量法配制。称取五氯硝基苯农药纯度标准物质约0.201 17 g，置于2 000 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至标线，充分混匀，静置。在洁净室中将制备好的溶液标准物质分装于2 mL 安瓿瓶中，共分装200支，于4℃下储存。

1.3 仪器工作条件

色谱柱：Inertsil ODS–3 柱(4.6 mm×150 mm，5 μm，日本GL Sciences 公司)；流动相：甲醇–水溶液(体积比为95∶5)，流量为1.0 mL／min；柱温：25℃；进样体积：5 μL；运行时间：10 min；检测波长：220 nm。

1.4 均匀性检验

根据JJF 1343–2012 《标准物质定值的通用原则及统计学原理的要求》［10］，从分装好的200 支样品中随机抽取15 瓶，在1.3 仪器工作条件下分别进行测定，每瓶测定3 次，以3 次测定结果的平均值作为一瓶的测定结果，利用F 检验判定标准物质的均匀性。

1.5 稳定性检验

1.5.1 短期稳定性

模拟标准物质运输和传递过程，在50℃温度条件下进行短期稳定性考察。分别在第0，2，3，4，5，6，7 天随机抽取3 瓶样品，在1.3 仪器工作条件下分别进行测定，采用直线拟合法对测定结果进行短期稳定性评价。

1.5.2 长期稳定性

将制备的标准物质于4℃下保存并进行为期12 个月的长期稳定性试验。按照前密后疏的原 则［10–11］，分别在第0，2，3，4，5，6，12 个月随机抽取7瓶样品，在1.3 仪器工作条件下分别进行测定，每瓶样品测定3 次，计算平均值。每次测试均以新制备的溶液作为标准样品对储存样进行定值，采用直线拟合法对测定结果进行长期稳定性评估。

2 结果与讨论

2.1 均匀性检验

按照1.4 方法对制备的标准物质进行均匀性检验，甲醇中五氯硝基苯溶液标准物质均匀性检验及方差分析结果见表1 和表2。

表1 甲醇中五氯硝基苯溶液标准物质均匀性检验结果

表2 单因素方差分析结果

ISO 导则35–2017 第7.10 条款给出了均匀性检查的4 种方法［12］。按照其中第二种方法，计算标准物质定值结果的标准不确定度，如果能够满足应用需求则判断其均匀性合格。五氯硝基苯溶液标准物质主要用于食品中五氯硝基苯残留测定，按照国标方法［12–14］规定，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%，最大允许误差为15%／2=7.5%。当标准物质的不确定度小于最大允许误差的三分之一（即2.5%）时对测量结果产生的影响可以忽略不计，满足预期用途。计算结果表明，该标准物质定值结果的标准不确定度为0.9%，扩展不确定度为1.8%，满足应用需要，由此判断制备的溶液标准物质均匀性良好。

2.2 稳定性检验

2.2.1 短期稳定性

按照1.5.1 方法对制备的五氯硝基苯溶液标准物质进行短期稳定性检验，测定结果见表3。以测定日期为自变量，以五氯硝基苯含量为因变量进行线性回归，得直线斜率b1= –9.286×10–5，标准偏差s=0.000 138 4，直线截距b0=0.100 1，斜率 不 确 定 度s(b1)=2.615×10–4，查 表 得t=2.57，则t·s(b1)=6.720×10–4，|b1|＜t·s(b1)，表明直线斜率不显著，制得的甲醇中五氯硝基苯溶液标准物质短期稳定性良好，在运输过程中能够保持量值稳定。

表3 短期稳定性检测结果

2.2.2 长期稳定性

按照1.5.2 方法对研制的标准物质进行长期稳定性检验，结果见表4。

表4 长期稳定性检测结果

以检测月份为自变量，以五氯硝基苯含量测定平均值为因变量进行线性回归，得直线斜率b1=1.703×10–6，标准偏差s=2.020×10–4，直线截距b0=0.099 95，斜率不确定度s(b1)=8.151×10–6，查表得t=2.57，则t·s(b1)=2.055×10–5，|b1|＜t·s(b1)，表明直线斜率不显著，制得的甲醇中五氯硝基苯溶液标准物质长期稳定性良好。

2.3 标准物质的定值

标准物质的浓度按式(1)计算：

式中：c——五氯硝基苯的质量浓度，mg／mL；

m——称量的五氯硝基苯农药纯度标准物质的质量，g；

p——五氯硝基苯农药纯度标准物质的纯度，%；

V——溶液定容体积，mL。

称取纯度为99.5%的五氯硝基苯农药纯度标准物质0.201 17 g，定容体积为2 000 mL。按照公式(1)计算甲醇中五氯硝基苯溶液标准物质的浓度为0.100 08 mg／mL，取3 位有效数字，最终浓度值为0.100 mg／mL。

3 不确定度评定

3.1 不确定度来源

根据公式(1)及各影响因素建立标准物质不确定度评估模型［15–20］，如式(2)所示。

式中：fC——与测量精密度相关的修正因子；

fT——与温度相关的修正因子；

fH——与均匀性相关的修正因子；

fS——与稳定性相关的修正因子。

由式(2)可知，标准物质的不确定度主要包括三部分：（1）定值的标准不确定度分量，采用重量–容量法配制溶液标准物质，以液相色谱法进行量值核验，则定值的不确定度主要包括标准物质纯度引入的不确定度u(p)、称量质量引入的不确定度u(m)、定容体积引入的不确定度u(V)、定值核验测量的重复性引入的不确定度u(fC)及温度差异引入的不确定度u(fT)；（2）均匀性引入的不确定度分量u(fH)；（3）稳定性引入的不确定度分量u(fS)。

3.2 不确定度分量

3.2.1 标准物质纯度引入的标准不确定度u(p)

根据标准物质定值结果，五氯硝基苯农药纯度标准物质定值的扩展不确定度为0.3%(k=2)，则五氯硝基苯农药纯度标准物质纯度引入的标准不确定度u(p)=0.3%／2=0.15%。

3.2.2 称量质量引入的标准不确定度u(m)

根据称量所使用电子天平检定证书，0.01～5 g 天平的示值误差为0.02 mg，重复性为0.05 mg，二者合在一起最大为0.07 mg，即占总称量质量0.2 g 的0.003 5%，按均匀分布，k=，因为是2 次称量，则称量质量引入的标准不确定度u(m)=0.003 5%=0.003%。

3.2.6 不均匀性引入的标准不确定度u(fH)

不均匀性引入的标准不确定度u(fH)等于均匀性检验不确定度ubb，根据表2 数据，u(fH)=ubb=0.30%。

3.2.7 不稳定性引入的标准不确定度u(fS)

3.3 合成标准不确定度

以上各不确定度分量互不相关，合成上述各不确定度分量，得标准物质定值的合成标准不确定度：

3.4 扩展不确定度

取包含因子k=2，扩展不确定度U=kuc=1.8%。

4 结语

用重量–容量法制备了甲醇中五氯硝基苯溶液标准物质。该标准物质均匀性良好，有效期为12 个月，标准值为0.100 mg／mL，扩展不确定度为1.8%。制备的五氯硝基苯溶液标准物质可用于蔬菜、茶叶、中药材、土壤等中的农药残留日常分析与检测，为分析量值的准确、可靠提供保障。