4-硝基苯胺降解菌的筛选及其代谢物研究

华益伟 彭世文 凌敏

摘要    为解决4-硝基苯胺（4-NA）难以降解的难题，本研究采用梯度驯化法分离筛选到一种对4-硝基苯胺具有较高耐受能力的细菌HY18，其10 mL LB发酵液48 h对100 mL浓度为40 mg/L的4-硝基苯胺溶液的去除率可达69.88%。通过形态观察和16S rDNA测序试验，细菌HY18被鉴定为苍白杆菌（Ochrobactrum sp.）。选取大肠杆菌作为指示微生物以及绿豆作为指示植物，对中间产物进行毒性分析。结果表明，该生物降解过程低毒无害，与环境相容性好。本研究筛选的降解菌HY18可以为4-硝基苯胺污染修复提供有效解决方案。

关键词    4-硝基苯胺;生物降解;中间产物;代谢途径;毒性分析

中图分类号    X53        文献标识码    A        文章编号   1007-5739（2018）23-0181-03

硝基苯类物质在农药、炸药、染料、聚合物及香料等化工生产中广泛使用，使该类物质在环境中不断积累，污染危害严重。我国把苯胺类化合物列入环境中的重点污染物，最高容许排放浓度为5 mg/L[1]。硝基苯类物质中4-硝基苯胺（4-NA）是一种重要的化工原料，其使用量大，也是常见的工业排放物，被国家环境保护总局规定为优先控制污染物[2]。4-硝基苯胺可通过呼吸和消化途径进入人体，促使氧与血红蛋白结合变为高铁血红蛋白，影响供氧而造成窒息，且对人体有很强的致癌性[3]。4-硝基苯胺毒性大、降解处理困难，国内研究较少，至今绝大多数采用物理、化学法进行处理，但这些方法费用偏高，且操作要求较为严格，因而在生物降解方面研究较少[4-9]。因此，研究4-硝基苯胺的生物降解，对保护环境和人类健康具有重要意义。本研究从4-硝基苯胺污染的土壤中筛选到具有对4-硝基苯胺生物降解能力的功能微生物苍白杆菌属（Ochrobactrum sp.）菌株HY18，并对降解产物进行了毒性检验分析、鉴定并推测4-硝基苯胺的生物降解路径。

1    材料与方法

1.1    供试土样

土壤样品采自长期受4-硝基苯胺污染的土地。用灭菌土钻钻取水稻田5～20 cm土壤2 kg，混匀后分装于无菌密封袋，放于冰盒中带回实验室于4 ℃保存。

1.2    培养基配方

1.2.1    富集培養基。4-硝基苯胺5 mg/L，葡萄糖15 g/L，KH2PO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO4 4.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH值7.0～7.2。

1.2.2    LB培养基。蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，固体培养基加琼脂粉18 g/L，pH值7.0～7.2。

1.2.3    筛选培养基。4-硝基苯胺5 mg/L，葡萄糖15 g/L，NaCl 5 g/L，固体培养基加琼脂粉18 g/L，pH值7.0～7.2。

1.3    试验方法

1.3.1    4-硝基苯胺降解菌的筛选与鉴定。采用摇瓶富集培养：取土壤样品各10 g溶于100 mL无菌去离子水中，磁力搅拌30 min制备土壤悬浮液。取土壤悬浮液1 mL接种于100 mL浓度为5 mg/L的4-硝基苯胺的富集培养基中，置于振荡培养箱中在37 ℃、150 r/min条件下富集培养3 d。取1 mL细菌富集液进行10倍梯度稀释，取100 μL稀释液涂布于4-硝基苯胺浓度为5 mg/L的筛选平板培养基上;于37 ℃培养3 d后，将生长良好的菌落继续依次转接至浓度为10、20、40 mg/L的筛选平板培养基上;于37 ℃培养3 d后，选取在浓度为40 mg/L的4-硝基苯胺筛选平板培养基上生长情况最好的细菌为4-硝基苯胺耐受菌。将筛选到的菌株转接于LB平板上，进行划线分离纯化，接种于LB液体培养基发酵，用40%甘油于-70 ℃保存。

4-硝基苯胺的含量采用高效液相色谱来检测，测定方法参照文献[10-12]，并进行了改进。检测条件：高效液相色谱仪为Agilent 1260;检测器为2498紫外/可见光检测器，检测波长为265 nm;色谱柱为ZORBAX SB-C18（4.6 mm× 150 mm，5 μm）;流动相为甲醇∶水=60∶40（体积比），流速为0.8 mL/min;进样量为10 μL;柱温为37 ℃。

无菌条件下，挑取4 ℃保存于斜面上的4-硝基苯胺耐受菌菌株，接种于无菌LB液体培养基中，于37 ℃、180 r/min的恒温摇床中培养8～10 h制成种子液;将种子液按2%的比例接种于不含4-硝基苯胺的富集培养基中，置于37 ℃、180 r/min的恒温摇床中培养48 h，得到耐受菌发酵液。配制浓度为40 mg/L的4-硝基苯胺溶液，将10 mL耐受菌发酵液接种至100 mL 4-硝基苯胺溶液中，在恒温摇床中以120 r/min振荡培养，3 d后将摇瓶中溶液定容至100 mL测定耐受菌对4-硝基苯胺的降解率。选择降解能力最大的耐受菌为最终降解菌，并进行菌种鉴定[13]。

配制浓度为40 mg/L的4-硝基苯胺溶液，将10 mL降解菌发酵液接种至100 mL 4-硝基苯胺溶液中，在恒温摇床中振荡培养（转速120 r/min），测定随时间变化4-硝基苯胺浓度的变化，绘制降解曲线，测定时间分别为0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0、36.0、48.0、60.0 h。

16S rDNA基因序列分析：以提取菌株的基因组为模板，用细菌16S rDNA 通用引物进行PCR 扩增，参照天根生化科技有限公司的DNA胶回收试剂盒对PCR产物进行回收，纯化后的产物测序由北京奥科生物技术有限责任公司的ABI 3730XL自动测序仪完成。所得序列与GenBank数据库中序列进行Blast比对分析，利用Mega 4.0构建系统进化树，根据菌株间的亲缘关系确定菌株的种属[13]。

1.3.2    降解物的毒性分析。测定4-硝基苯胺及其代谢物的毒性，测定其抑制效果[14-16]。选取大肠杆菌（Escherichia coli）作为指示微生物，测定4-硝基苯胺及其代谢物的毒性。将大肠杆菌接种至LB培养基中，于30 ℃摇床培养24 h。取25 mL发酵液分别加入25 mL浓度为50、100 mg/L的4-硝基苯胺或其代谢物，使4-硝基苯胺或其代谢物的最终浓度分别为25、50 mg/L。每个处理设置3个重复，对照组加蒸馏水。24 h后通过梯度稀释平板计数法测定大肠杆菌活细胞数，通过与对照组对比计算大肠杆菌抑制率。

选取绿豆作为指示植物，测定4-硝基苯胺及其代谢物的毒性。在湿润的定性滤纸上种植20粒种子，待种子发芽露白后分别滴加10 mL浓度为25、50 mg/L的4-硝基苯胺或其代谢物。每个处理设置3次重复，对照组加蒸馏水，放置于人工气候箱培养4 d，观察不同组分对绿豆幼苗的生长状况，测定记录其苗长，计算平均值。

2    结果与分析

2.1    4-硝基苯胺降解菌的筛选

从4-硝基苯胺污染的土壤中取样，通过摇瓶富集培养、不同4-硝基苯胺浓度筛选培养基梯度筛选的方法获得4-硝基苯胺耐受菌。测定耐受菌是否对4-硝基苯胺有降解能力，选择降解率最大的耐受菌为降解菌。

采取4-硝基苯胺浓度梯度驯化法，初筛结果如表1所示，从浓度为5 mg/L的4-硝基苯胺的LB平板上筛选到不同的菌落共计22个。继续转接至10、20 mg/L等浓度的LB平板上，其中大部分菌落耐性逐渐减弱，剩下7个仍表现出较好的生长情况。直至转接于40 mg/L培养基，仅剩下3个菌落仍具有较强4-硝基苯胺耐受性。从中选出生长情况较好的菌株HY8、HY16、HY18作为进一步研究的供试菌种，测定其对4-硝基苯胺的降解率。

配制浓度为40 mg/L的4-硝基苯胺溶液，10 mL耐受菌HY8、HY16、HY18发酵液接种至100 mL 4-硝基苯胺溶液中，在恒温摇床中振荡培养（转速120 r/min）。3 d后将摇瓶中溶液定容至100 mL，测定耐受菌对4-硝基苯胺降解率，结果如图1所示。耐受菌HY8、HY16、HY18降解3 d后对4-硝基苯胺降解率分别为43.57%、35.8%、68.62%，选择降解能力最强的耐受菌HY18为最终降解菌。

通过接种降解菌HY18，4-硝基苯胺被降解为次生代谢物，此生物降解过程释放的能量被转化为ATP供苍白杆菌HY18存活和生长繁殖;4-硝基苯胺的一部分C和N元素被HY18吸收用于组成其细胞各种结构。刚接种时，4-NA溶液中降解菌菌数最大，但由于细菌对环境需要一个适应过程，故在0～2 h内，细菌对4-NA降解率较低，2 h降解率为3.9%;此后，细菌HY18降解4-硝基苯胺速率加快，8 h降解率达21.1%，24 h时降解率达61.06%;此后，由于营养匮乏，细菌细胞逐渐死亡，降解速度下降，36 h降解率为65.49%;48 h对4-NA的降解率达到最高值，为69.88%（图2）。

通过接种HY18，4-硝基苯胺能够很好地被降解。由于降解试验设置4-硝基苯胺浓度为40 mg/L，用10 mL降解菌发酵液降解100 mL不含其他营养物质的4-硝基苯胺溶液，则4-硝基苯胺48 h降解率仍然达69.88%。由此可见，HY18对4-硝基苯胺具有比较好的生物降解效果，是一种应用前景较好的微生物。若在4-硝基苯胺溶液中添加如葡萄糖等营养物质，降解菌HY18可以继续生长，其对4-硝基苯胺的降解率将会更高。

2.2    4-硝基苯胺降解菌的鉴定

HY18接种在LB平板培养基上，于37 ℃培养3 d后，菌落湿润带浅黄色，边缘整齐光滑且颜色较中间稍浅，有光泽，中间稍稍隆起，革兰氏染色试验结果为阴性。在光学显微镜下观察发现，该细菌无芽孢形成，呈细杆状。

将菌株HY18的16S rDNA基因序列与GenBank的核酸序列进行同源性比对（Blast），菌株HY18同Ochrobactrum sp.（KF987808）的相似度达到99%。使用软件Mega 4.0以Neighbor-Joining法构建系统发育树，结果如图3所示，并结合各菌株菌落形态特征，菌株HY18被鉴定为苍白桿菌（Ochrobactrum sp.）。

2.3    降解产物毒性分析

由图4可以看出，4-硝基苯胺对大肠杆菌和绿豆2种指示生物都有较强的抑制作用，而4-硝基苯胺代谢物对大肠杆菌和绿豆的毒性较低。

大肠杆菌接种至4-硝基苯胺溶液中细胞死亡数较高，25、50 mg/L的4-硝基苯胺对大肠杆菌的抑制率分别高达81.4%、87.4%。而4-硝基苯胺代谢物对大肠杆菌抑制率较低，分别为19.2%、32.7%。

在蒸馏水对照组的影响下，对照组绿豆苗长的平均值为5.4 cm;滴加25、50 mg/L的4-硝基苯胺后，绿豆生长受到抑制，苗长分别2.3、1.9 cm;滴加25、50 mg/L的4-硝基苯胺代谢物对绿豆生长抑制作用则比较弱，苗长分别达4.7、3.6 cm。

由上述结果可知，4-硝基苯胺对大肠杆菌及绿豆有巨大的毒害作用，通过苍白杆菌HY18的降解后，大部分4-硝基苯胺被利用，其代谢物对2种指示生物的抑制作用较低。试验结果表明，通过筛选出的降解菌对4-硝基苯胺进行降解，含有4-硝基苯胺的溶液生物毒性明显降低。

3    结论与讨论

本研究筛选获得了能够对4-硝基苯胺进行生物降解的功能菌苍白杆菌HY18（Ochrobactrum sp.），此前苍白杆菌仅在间苯氧基苯甲醛降解上有报道，未见对4-硝基苯胺有生物降解能力方面的报道;研究了HY18的生长降解曲线，证实了其对4-硝基苯胺具有比较好的生物降解效果，其LB培养基发酵液对4-硝基苯胺的去除率可达69.88%;毒性分析试验结果显示，4-硝基苯胺降解代谢物低毒无害。以上结果表明，降解菌HY18具有解决土壤中4-硝基苯胺污染问题的巨大潜能。

4    参考文献

[1] 陈宜菲，邱罡，陈少瑾.废铁屑预处理被4-硝基苯胺污染的土壤[J].环境科学与技术，2010，33（12）：134-138.

[2] 陈忠林，马军，李圭白，等.受硝基苯污染松花江原水的应急处理工艺研究[J].中国给水排水，2006，22（13）：1-5.

[3] ADRIAN S.Hight rate biodegradation of 3-and 4-nitroaniline[J].Fraunhofer Management，1999，39（13）：2325-2346.

[4] 沈晓莉，王健鑫，陈小龙，等.一株对硝基苯胺降解菌Microbacterium sp.PNA8的分离鉴定及其降解条件研究[J].微生物学通报，2009，36（10）：1496-1500.

[5] KHALID A，ARSHAD M，CROWLEY D E.Biodegradation potential of pure and mixed bacterial cultures for removal of 4-nitroaniline from textile dye wastewater[J].Water Research，2009，43（4）：1110-1116.

[6] QURESHI A，VERMA V，KAPLEY A.Degradation of 4-nitroaniline by Stenotrophomonas strain HPC 135[J].International Biodeterioration & Biodegradation，2007，60（4）：215-218.

[7] 付荣华，焦香苹.催化氧化法处理对硝基苯胺废水[J].河南化工，2006，23（10）：22-24.

[8] 范铮，张国亮，潘志彦，等.光合细菌降解对硝基苯胺废水的试验研究[J].水处理技术，2012，38（8）：106-109.

[9] 方玲.降解有机氯农药的微生物菌株分离筛选及应用效果[J].应用生态学报，2000，11（2）：249-252.

[10] 宋彩霞，邓新平，厉阗，等.对硝基苯胺耐盐降解菌S8的筛选及特性研究[J].环境科学，2014，35（3）：1176-1182.

[11] 陈昀.环境样品中硝基苯胺类化合物的液相色谱测定方法研究[D].杭州：浙江師范大学，2013.

[12] 卢佩章，张玉奎，梁鑫淼.高效液相色谱法及其专家系统[M].沈阳：辽宁科学技术出版社，1992.

[13] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[14] 宋亚丽.水中硝基苯类化合物的超声波/锌降解效果及机理[D].哈尔滨：哈尔滨工业大学，2013.

[15] 武坤，王亚兵，王莉萍，等.硝基苯类废水处理研究进展[J].化学推进剂与高分子材料，2010，8（3）：34-37.

[16] 郑凯，林平，季仁杰，等.锰掺杂二氧化钛降解4-硝基苯胺试验研究[J].环境工程，2015（增刊1）：1-5.