反相高效液相色谱法检测风湿骨痛胶囊中盐酸麻黄碱、苯甲酰乌头原碱和齐墩果酸的含量

李明蕊，梁 悦，张 静，赵 婷，许保海#

(1.北京积水潭医院中药房，北京 100096；2.首都医科大学中医药学院实验教学中心，北京 100069)

风湿性关节炎(rheumatic arthritis，RA)在我国发病率约为0.42%，男女患病比例约为1∶4，RA不仅造成患者身体机能和生活质量下降，而且给家庭、社会带来了较大的经济负担[1-3]。风湿骨痛胶囊由制川乌、制草乌、红花、甘草、木瓜、乌梅和麻黄等7味中药材，采用粉碎、煎煮、过滤及干燥等工序加工制成，具有温经散寒、通络止痛等功效，常用于治疗寒湿痹阻经络所致的痹病，如腰脊疼痛、四肢关节冷痛等病症，风湿性关节炎患者见上述证候者[4-6]。方中，制川乌和制草乌具有祛风除湿、温经止痛等功效[7-10]；木瓜具有舒筋活络、和胃化湿等功效[11-14]；麻黄具有发汗散寒、宣肺平喘和利水消肿等功效[15-18]。风湿骨痛胶囊现收载于《中华人民共和国药典：一部》(2015年版)中，采用紫外可见分光光法测定乌头总生物碱和高效液相色谱法检测盐酸麻黄碱的含量[19]，不能更全面地显示该产品的质量水平，且分析检测时间较长，效率偏低。为有效控制该制剂的质量，提高检测效率，本研究建立反相高效液相色谱法(reversed phase high performance liquid chromato-graphy，RP-HPLC)检测风湿骨痛胶囊中的盐酸麻黄碱、苯甲酰乌头原碱和齐墩果酸等活性成分的含量，现报告如下。

1 材料

1.1 仪器

Agilient 1260 infinity型高效液相色谱仪，配备G1314B型二极管阵列检测器(美国Agilent科技公司)；Sartorius SECURA225D-1CN型电子天平(德国Sartorius科技公司)；JB 1045SF型超声波清洗器(杭州净宝超声波科技公司)；Milli-Q Direct 16 型超纯水一体化系统(美国密理博科技公司)。

1.2 药品与试剂

风湿骨痛胶囊(安徽精方药业股份有限公司，批号：190402、190508、190713，规格为每粒装0.3 g)；对照品：苯甲酰乌头原碱(批号为111794-201705，含量以99.1%计)，盐酸麻黄碱(批号为171241-201809，含量以100.0%计)，齐墩果酸(批号为110709-201808，含量以91.1%计)，均购于中国食品药品检定研究院；实验用水为超纯水，自制；乙腈、甲醇均为色谱纯，购自MERCK试剂；其他辅助试剂均为分析纯，购自国药集团。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Shim-pack CLC ODS-C18液相色谱柱(型号：250 mm×4.6 mm, 5.0 μm，日本SHIMAZU科技公司)。流动相A：乙腈-甲醇(V∶V=60∶40)，流动相B：0.1 mol/L乙酸铵溶液(每1 000 ml加0.5 ml冰乙酸)，梯度洗脱；洗脱程序：0～7 min，3%A；7～16 min，3%～38%A；16～23 min，38%～89%A；23～29 min，89%A；29～32 min，89%～3%A；32～39 min，3%A。检测波长：221 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：25 ℃；进样量：25 μl。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品混合储备溶液：精密称取苯甲酰乌头原碱对照品2 477 μg、盐酸麻黄碱对照品2 000 μg和齐墩果酸对照品4 555 μg，置于50 ml容量瓶中，加乙腈-甲醇溶液(V∶V=60∶40)制备每1 ml溶液中含苯甲酰乌头原碱49.55 μg、盐酸麻黄碱40 μg和齐墩果酸91.1 μg的混合标准溶液。

2.2.2 对照品溶液：精密移取“2.2.1”项下对照品混合储备溶液1.0 ml，置于10 ml容量瓶中，加乙腈-甲醇溶液定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液，对照品溶液中每1 ml分别含苯甲酰乌头原碱4.955 μg、盐酸麻黄碱4 μg和齐墩果酸9.11 μg。

2.2.3 供试品溶液：取市售风湿骨痛胶囊样品，共取20粒，除去胶囊壳，内容物研细，取约1.0 g，精密称定，置于50 ml容量瓶中，加乙腈-甲醇溶液约35 ml，超声提取20 min(超声功率300 W，频率50 kHz)，取出放冷至室温(25 ℃)，加乙腈-甲醇溶液定容至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜过滤后，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.4 阴性样品溶液：按风湿骨痛胶囊制备工艺和药材比例，按药典方法制备缺制川乌、制草乌、木瓜和麻黄的阴性样品，阴性样品按“2.2.3”项下供试品溶液制备方法进行处理，制得阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察：分别取“2.2.2”项下对照品溶液、“2.2.3”项下供试品溶液和“2.2.4”项下阴性样品溶液，按“2.1”色谱条件，分别进样25 μl，记录色谱图。结果显示，阴性对照溶液色谱图中，未出现与公示品溶液色谱图、对照品溶液色谱图保留时间一致的色谱峰，阴性对照无干扰，方法专属性良好，见图1。

A.空白溶液；B.对照品溶液；C.供试品溶液；D.阴性样品溶液；1.盐酸麻黄碱；2.苯甲酰乌头原碱；3.齐墩果酸

2.3.2 系统适应性试验：取“2.2.2”项下对照品溶液和“2.2.3”项下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别进样分析。3种待测成分均能达到基线分离，以盐酸麻黄碱色谱峰计算理论塔板数>5 000，且各色谱峰之间分离度均>1.5。

2.3.3 精密度试验：取“2.2.2”项下对照品溶液，每1 ml分别含苯甲酰乌头原碱、盐酸麻黄碱和齐墩果酸4.955、4和9.11 μg，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6针，记录色谱图，按3种待测组分6次进样测定峰面积计算相对标准偏差(RSD)。结果显示，盐酸麻黄碱、苯甲酰乌头原碱和齐墩果酸峰面积的RSD分别为1.16%、0.92%和1.49%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验：取市售风湿骨痛胶囊样品(批号：190402)，按“2.2.3”项下供试品溶液制备方法进行前处理，制得供试品溶液，同法共制备6份供试品溶液，6份供试品溶液质量浓度依次为20.42、22.64、19.74、20.06、19.96和20.02 mg/ml；按“2.1”项下色谱条件，6份供试品溶液各进样1针，记录色谱图，按3种待测组分峰面积计算检测结果，根据6次检测结果计算RSD。结果显示,盐酸麻黄碱、苯甲酰乌头原碱和齐墩果酸6次测定结果的RSD分别为4.21%、3.08%和3.17%，表明方法具有良好的重复性。

2.3.5 线性关系考察：取“2.2.1”项下对照品混合储备溶液，分别精密量取100 μl、500 μl、1.0 ml、5.0 ml和10.0 ml，分别置于10 ml容量瓶中，加乙腈-甲醇溶液定容至刻度，摇匀，制备一系列含盐酸麻黄碱、苯甲酰乌头原碱和齐墩果酸的混合标准溶液；按“2.1”项下色谱条件，以上溶液分别进样25 μl，记录色谱图；以各成分响应峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)制作标准曲线，得3种成分的标准曲线方程。采用逐级稀释法计算，以信噪比(S/N)为3时，计算各成分的检测限，再以信噪比(S/N)为10时，计算各成分定量限，结果见表1。

表1 3种成分的标准曲线方程、相关系数及范围

2.3.6 稳定性试验：取市售风湿骨痛胶囊样品(批号：190402)，按“2.2.3”项下供试品溶液制备方法进行前处理，制得供试品溶液，室温下放置，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12及24 h后进样测定，记录色谱图，按3种待测组分峰面积计算RSD。结果显示，盐酸麻黄碱、苯甲酰乌头原碱和齐墩果酸峰面积RSD分别为1.54%、0.69%和1.33%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.7 加标回收试验：取市售风湿骨痛胶囊样品，共取20粒，除去胶囊壳，内容物研细，取约1.0 g，精密称定，置于50 ml容量瓶中，精密移取“2.2.1”项下混合对照品储备溶液适量，加入到上述量瓶中，后续按“2.2.3”项下供试品溶液制备方法进行前处理，同法共制备6份样品加标溶液；按“2.1”项下仪器条件，6份加标溶液各进样1针，记录色谱图，计算3种待测组分回收率。结果见表2。

表2 样品加标回收率结果

2.3.8 市售样品含量测定：取市售风湿骨痛胶囊样品(批号为190402、190508及190713，规格为每粒装0.3 g)，按“2.2.3”项下供试品溶液制备方法进行前处理，按“2.1”项下色谱条件，分别进样25 μl，记录色谱图，按盐酸麻黄碱、苯甲酰乌头原碱和齐墩果酸峰面积计算样品中含量，结果见表3。

表3 市售样品含量测定结果(mg/g)

3 讨论

3.1 检测成分的确定

中成药中待测组分的确定，对提高产品质量控制具有重要的意义。风湿骨痛胶囊由制川乌、制草乌、木瓜及麻黄等7味中药材制成，处方中药味较多，基质成分较为复杂，其中制草乌和制川乌为该药活性成分和毒性成分来源。风湿骨痛胶囊中，制草乌和制川乌作为君药，麻黄为臣药，木瓜为佐药。为有效控制该产品的质量水平，考虑到该类中成药的君臣佐使作用，本研究确定制草乌、制川乌、麻黄和木瓜中活性成分苯甲酰乌头原碱、盐酸麻黄碱和齐墩果酸作为质量控制的目标物。

3.2 检测波长的确定

取苯甲酰乌头原碱对照品，加乙腈-甲醇溶液制备1 ml溶液中含浓度为5.0 μg/ml的波长测试溶液，同法制备盐酸麻黄碱和齐墩果酸浓度为5.0 μg/ml的波长测试溶液；按“2.1”项下色谱条件，设置二极管阵列检测器波长扫描范围为200～400 nm，上述溶液分别进样25 μl，记录色谱图和光谱图。结果发现，苯甲酰乌头原碱的最大吸收波长在234 nm附近，盐酸麻黄碱在212 nm附近，齐墩果酸在211 nm附近，3个成分最大吸收波长接近，为使各成分响应良好，且定性、定量结果准确，实验最终确定221 nm作为检测波长。

3.3 流动相的确定

取“2.2.2”项下对照品溶液、“2.2.3”项下供试品溶液和“2.2.4”项下阴性样品溶液，取对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，保持其他条件不变，分别将甲醇-0.1 mol/L乙酸铵溶液、乙腈-0.1 mol/L乙酸铵溶液和甲醇-乙腈溶液-0.1 mol/L乙酸铵溶液作为流动相体系，考察其对上述溶液中苯甲酰乌头原碱、盐酸麻黄碱和齐墩果酸分离情况的影响。结果表明，甲醇-乙腈溶液-0.1 mol/L乙酸铵溶液作为流动相体系时，3种待测组分分离效果最好，且基质干扰无。

3.4 提取条件的确定

风湿骨痛胶囊样品基质较为复杂，由7味药材组成，因此，选择最佳的提取条件对提高检测结果准确度、降低基质干扰等具有重要的作用。本研究分别考察75%甲醇、甲醇、乙腈和甲醇-乙腈溶液作为提取溶剂时，对风湿骨痛胶囊中苯甲酰乌头原碱、盐酸麻黄碱和齐墩果酸的提取效果，结果表明，采用甲醇-乙腈溶液时提取效果最佳。确定提取溶剂后，考察超声功率、时间的影响，最终确定最佳的提取条件为：甲醇-乙腈溶液作为提取溶剂，超声功率控制在300 W，时间控制在20 min。

综上所述，本研究采用RP-HPLC法检测风湿骨痛胶囊中的盐酸麻黄碱、苯甲酰乌头原碱和齐墩果酸活性成分含量的分析方法，确定了待测组分、检测波长和提取条件，考察了方法的专属性、线性等。此方法具有前处理简单、检测结果准确及重复性好等特点，适用于风湿骨痛胶囊产品的质量控制。