苯甲酰芍药苷对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤保护作用及分子机制研究

周垂杨 杨 明 高仁贤

急性肺损伤（ALI）及其更严重形式急性呼吸窘迫综合征（ARDS）病理过程是由于肺部广泛的炎症反应，可能导致肺间质水肿，肺顺应性恶化，引起严重低氧血症[1-2]。ALI 死亡率较高，约为40%[3]。ALI 的发病机制是由累积和激活的炎症细胞，促炎性细胞因子和趋化因子的分泌以及活性氧类别（ROS）的释放导致的急性炎症反应[4-5]。研究表明，抗炎介质或抗炎药物可以治疗早期ALI[6]。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌中外膜的主要成分，是先天免疫系统的极强刺激物，在数种动物模型中常被用来诱导ALI[7-8]。近年研究发现，部分中药用于治疗ALI 具有较好疗效，其作用机制与炎症信号调控和microRNA 生成有关[9]。苯甲酰芍药苷是毛茛科植物芍药、牡丹根部（赤芍）的提取物芍药总苷中的单体成分，此前研究发现，芍药总苷能够减轻LPS 诱导的小鼠ALI，然而其具体作用成分尚不明确[10]。基于此，本研究探讨苯甲酰芍药苷对小鼠ALI 的作用。

1 实验材料

1.1 动 物 实验用75 只SPF 级雄性C57BL/6J 小鼠，体质量22～25g，6～7 周龄，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，实验动物使用许可证号：SCXK（沪）2018-0006。小鼠饲养于温度18～26℃、相对湿度40%～70%环境中，自由饮水进食，昼夜各12h。本实验研究经浙江中医药大学第二附属医院实验动物伦理委员会审核通过，批准编号：SYXK（浙）2018-0012。

1.2 细 胞 小鼠巨噬细胞系RAW264.7（批号260748）购自南京科佰生物科技有限公司。

1.3 药 物 苯甲酰芍药苷（批号51165123）购自深圳虹彩祥根生物科技有限公司，溶于无菌生理盐水，配制成低浓度0.625mg/mL 及高浓度1.250mg/mL，动物及细胞实验用苯甲酰芍药苷参考芍药总苷动物实验用量。

1.4 试 剂 血必净注射液（规格：10mL×5 支/盒，批号190845）购自医院药房，产自天津红日药业股份有限公司；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（批号20180648）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA 试剂盒（批号1541216）、小鼠白介素-6（IL-6）ELISA 试剂盒（批号2165216）均购自艾美捷科技有限公司；微小RNA 520c-3p（miR-520c-3p）inhibitor 及对照品NC（批号21651）购自北京百奥莱博科技有限公司；磷酸化IκB激酶（p-IKKβ）兔单抗（批号26542）、IKKβ 兔单抗（批号22642）、核因子κB（NF-κB）p-p65 兔单抗（批号32645）、NF-κB p65 兔单抗（批号45142）均购自武汉三鹰生物技术有限公司，Actin 作为内参。

1.5 仪 器 上海恒平FA2004 电子分析天平购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司；GDW/GDJS-100高低温（湿热）试验箱购自上海苏盈试验仪器有限公司；Alpha 化学发光凝胶成像系统购自美国Cell Biosciences 公司；SpectraMax iD5 多功能微孔酶标仪购自美谷分子仪器（上海）有限公司；Life Technologies ABI QuantstudioTMDX 定量PCR 仪购自中山大学达安基因股份有限公司。

2 实验方法

2.1 小鼠ALI 模型构建及药物干预 将75 只SPF级小鼠按随机数字表法分成五组，每组15 只，分别为空白对照组、ALI 组、阳性对照组、苯甲酰芍药苷低剂量组、苯甲酰芍药苷高剂量组。小鼠造模前16h 内禁食，造模时使用4%水合氯醛麻醉，采用腹腔注射法，ALI 组、阳性对照组、苯甲酰芍药苷低、高剂量组小鼠腹腔注射2mg/kg LPS 100μL，空白对照组腹腔注射等体积生理盐水，4h 后苯甲酰芍药苷低剂量组小鼠腹腔注射2.5mg/kg 苯甲酰芍药苷100μL，高剂量组注射5.0mg/kg 苯甲酰芍药苷100μL，阳性对照组注射血必净注射液100μL，ALI 组和空白对照组注射相同剂量生理盐水。24h 后取肺组织称重，并计算湿/干重比。

2.2 小鼠肺组织石蜡切片HE 染色 取出小鼠肺组织后放入4%多聚甲醛进行固定，经TISSUE-TEK AUTOTEC A120 自动化样本制备系统实现组织石蜡包埋，制成0.4μm 石蜡切片。按照HE 染色试剂盒说明书操作进行染色，中性树脂分片，通过HE 全自动切片扫描仪扫描成像，选取HE 染色肺组织特征性区域展示。

2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测ALI 小鼠肺组织TNF-α、IL-6 水平 取约5mg 小鼠肺组织，在管中加入约300μL 完全提取缓冲液并用电动匀浆器匀浆，在4℃下以13000rpm 转速离心20min。取上清液放在预冷的新鲜试管中，并在-80℃下保存样品。按照ELISA 检测试剂盒操作步骤检测肺组织TNF-α、IL-6 水平。使用多功能酶标仪测定450nm 吸光度值。

2.4 蛋白免疫印迹（WB）法检测ALI 小鼠肺组织IKKβ、NF-κB p65 蛋白及其磷酸化水平 利用RIPA 强组织裂解液裂解组织蛋白后，经过离心取上清蛋白样，测定蛋白浓度，进行蛋白凝胶电泳。孵育一抗稀释比：IKKβ（1:1000）、p-IKKβ（1:1000）、NF-κB p65（1:1000）、NF-κB p-p65（1:1000）、Actin（1:5000）。利用化学二抗孵育并进行曝光分析。

2.5 细胞培养 小鼠巨噬细胞系RAW264.7 的完全培养基为含10%胎牛血清的DMEM 培养基，并加入1%的青霉素-链霉素双抗。于5%CO2、37℃恒温培养箱培养。细胞密度达到85%～90%进行传代。将A549铺板于6cm 皿中，分为五组：空白对照组、ALI 组、苯甲酰芍药苷组、苯甲酰芍药苷+miR-520c-3p inhibitor 组、苯甲酰芍药苷+miR-NC 组。后两组各预先转染miR-520c-3p inhibitor 和NC 24h。ALI 组、苯甲酰芍药苷组、苯甲酰芍药苷+miR-520c-3p inhibitor 组、苯甲酰芍药苷+miR-NC 组加入80ng/mL LPS 刺激，同时后三组加入苯甲酰芍药苷100ng/mL，空白对照组加入等体积生理盐水，处理6h 后提取RNA。关于探究miR-506-3p 抑制剂对苯甲酰芍药苷作用于细胞TNF-α、IL-6 的影响，设置四组：空白对照组给予生理盐水刺激6h；ALI 组给予LPS（80ng/mL）刺激6h；苯甲酰芍药苷组给予LPS（80ng/mL）刺激6h+苯甲酰芍药苷（100ng/mL）；苯甲酰芍药苷+miR-520c-3p inhibitor 组给予预转染miR-520c-3p inhibitor 24h，LPS（80ng/mL）刺激6h+苯甲酰芍药苷（100ng/mL）；苯甲酰芍药苷+miR-NC 组给予预转染miR-NC 24h，LPS（80ng/mL）刺激6h+苯甲酰芍药苷（100ng/mL）。收取细胞上清进行ELISA 法检测，具体步骤见上述。

2.6 RT-PCR 检测miR-520c-3p、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平 提取细胞RNA 后逆转为cDNA 进行RTPCR 检测，引物如下：miR-520c-3p 引物：forward 5′-ATCGCCGTGTAAAAGGAAGAGGGCTGAGGAATTCAT-3′，reverse 5′-CACTGGACTAGTGGAGGAGAGCACATAAAAACATC-3′；TNF-α 引物：forward 5′-CGGCTACCTAGTCTACGCC-3′，reverse 5′-AAGTCGCCGCCAATGTTGA-3′；NF-κB p65 引物：forward 5′-ATCCCATCTTTGACAATCGTGC-3′，reverse 5′-CTGGTCCCGTGAAATACACCTC-3′。引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司。反应程序：94℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环32 次。

2.7 统计学方法 应用SPSS 19.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（） 表示，数据分析组内比较采用t 检验，组间比较采用方差检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 苯甲酰芍药苷降低ALI 小鼠肺组织湿/干重比与空白对照组比较，ALI 组肺组织湿/干重比明显升高（P＜0.05），与ALI 组比较，苯甲酰芍药苷低、高剂量组及阳性对照组小鼠肺组织湿/干重比均明显下降（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠肺组织湿/干重比比较（）

表1 各组小鼠肺组织湿/干重比比较（）

注：空白对照组给予腹腔注射生理盐水200μL；ALI 组给予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+生理盐水100μL；阳性对照组给予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+血必净注射液100μL；苯甲酰芍药苷低剂量组给予腹腔注射LPS （2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍药苷（2.5mg/kg，100μL）；苯甲酰芍药苷高剂量组给予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍药苷（5.0mg/kg，100μL）；ALI 为急性肺损伤；与空白对照组比较，aP＜0.05；与ALI 组比较，bP＜0.05

3.2 苯甲酰芍药苷对各组ALI 小鼠肺组织病理变化的影响 空白对照组小鼠肺组织呈现气管黏膜纤毛柱状上皮细胞，呼吸道和肺泡上皮结构完整。肺泡形态均匀，纤毛排列整齐。而ALI 组小鼠肺泡和肺泡隔中可见大量炎性细胞浸润，肺泡隔中可见增厚。在肺组织观察到明显的毛细血管充血、水肿和肺泡出血，表明成功建立肺损伤模型。与ALI 组比较，苯甲酰芍药苷低、高剂量组小鼠肺组织炎性细胞浸润明显减少，肺泡中隔增厚情况减轻，毛细血管几乎无充血情况。见插页图1。

图1 各组大鼠肺组织病理变化（HE，100×）

3.3 苯甲酰芍药苷降低ALI 小鼠肺组织TNF-α、IL-6 水平 与空白对照组比较，ALI 组小鼠肺组织TNF-α、IL-6 水平明显升高（P＜0.05）；与ALI 组小鼠比较，苯甲酰芍药苷低、高剂量组及阳性对照组小鼠肺组织TNF-α、IL-6 水平均明显降低（P＜0.05）。见表2。

表2 苯甲酰芍药苷对ALI 小鼠肺组织TNF-α、IL-6 的影响（pg/mL，）

表2 苯甲酰芍药苷对ALI 小鼠肺组织TNF-α、IL-6 的影响（pg/mL，）

注：空白对照组给予腹腔注射生理盐水200μL；ALI 组给予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+生理盐水100μL；阳性对照组给予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+血必净注射液100μL；苯甲酰芍药苷低剂量组给予腹腔注射LPS （2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍药苷（2.5mg/kg，100μL）；苯甲酰芍药苷高剂量组给予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍药苷（5.0mg/kg，100μL）；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；IL-6 为白介素-6；ALI 为急性肺损伤；与空白对照组比较，aP＜0.05；与ALI 组比较，bP＜0.05

3.4 苯甲酰芍药苷抑制ALI 小鼠肺组织IKKβ/NFκB 信号 ALI 组IKKβ、NF-κB p65 磷酸化水平明显高于空白对照组，总IKKβ、NF-κB p65 表达无明显差异；苯甲酰芍药苷低、高剂量组与ALI 组比较，IKKβ、NF-κB p65 磷酸化水平明显下降，同时总NF-κB p65 水平也明显下降，总IKKβ 水平无明显变化。推测苯甲酰芍药苷可能通过抑制NF-κB 的表达抑制了炎症信号。见插页图2。

图2 各组小鼠肺组织IKKβ/NF-κB 及其磷酸化表达

3.5 苯甲酰芍药苷促进ALI 小鼠肺组织miR-520c-3p 表达 与空白对照组比较，ALI 组小鼠肺组织miR-520c-3p 表达明显下调（P＜0.05）；与ALI 组比较，苯甲酰芍药苷低、高剂量组及阳性对照组小鼠肺组织miR-520c-3p 表达均明显升高（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠肺组织miR-520c-3p 表达比较（）

表3 各组小鼠肺组织miR-520c-3p 表达比较（）

注：空白对照组给予腹腔注射生理盐水200μL；ALI 组给予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+生理盐水100μL；阳性对照组给予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+血必净注射液100μL；苯甲酰芍药苷低剂量组给予腹腔注射LPS （2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍药苷（2.5mg/kg，100μL）；苯甲酰芍药苷高剂量组给予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍药苷（5.0mg/kg，100μL）；ALI 为急性肺损伤；与空白对照组比较，aP＜0.05；与ALI 组比较，bP＜0.05

3.6 miR-506-3p 靶向NF-κB p65 亚基RELA 基因序列 通过microRNA 靶基因数据库Targetscan 7.0 软件分析结果显示，miR-506-3p 直接靶向NFκB p65 亚基RELA 基因3′UTR 序列。见表4。

表4 miR-506-3p 靶向NF-κB p65 亚基RELA 基因序列

3.7 miR-506-3p 抑制剂减轻苯甲酰芍药苷对TNFα、IL-6 表达抑制的影响 与空白对照组比较，ALI组细胞TNF-α、IL-6 mRNA 水平明显升高（P ＜0.05）；与ALI 组比较，苯甲酰芍药苷组TNF-α、IL-6 mRNA 水平明显下降（P＜0.05）；与苯甲酰芍药苷组比较，苯甲酰芍药苷+miR-520c-3p inhibitor 组TNFα、IL-6 mRNA 水平明显升高（P＜0.05），苯甲酰芍药苷+miR-NC 组TNF-α、IL-6 mRNA 表达无差异（P＞0.05）。见表5。

4 讨论

ALI 的特征在于急性炎性反应，炎性细胞浸润，渗出性分泌物，肺细胞死亡的释放以及随后的实质损伤。研究表明，巨噬细胞在ALI 急性期的免疫反应和炎症过程中也起着至关重要的作用，该过程通过释放炎性因子促进中性粒细胞募集进一步释放促炎性因子TNF-α、IL-6 等[11-12]。本研究发现，苯甲酰芍药苷能有效抑制LPS 诱导的小鼠肺组织TNF-α、IL-6 水平。因此，苯甲酰芍药苷可能通过抑制TNF-α、IL-6 的水平缓解LPS 诱导ALI。

为了进一步探究苯甲酰芍药苷缓解LPS 诱导ALI 的分子机制。本研究检测了小鼠肺组织中IKKβ/NF-κB 信号，结果显示，苯甲酰芍药苷能有效降低IKKβ、NF-κB p65 磷酸化水平以及总NF-κB p65水平。NF-κB 代表转录因子家族，通常通过与IκB 家族的抑制分子相互作用而在细胞质中保持失活。响应多种刺激（例如炎性细胞因子，细菌或病毒产物或各种类型的应激），IκB 分子在两个关键的丝氨酸残基上被磷酸化。该修饰允许它们的多泛素化和被蛋白酶体破坏。游离的NF-κB 进入细胞核并激活各种基因的转录，如TNF-α、IL-1β 和IL-6，这些基因参与了免疫和炎症反应，在ALI 发展和发病机制中起关键作用[13]。这也进一步提示苯甲酰芍药苷可能通过抑制IKKβ/NF-κB 信号活化减低TNF-α、IL-6 水平。

此前研究发现，miR-506-3p 靶向NF-κB p65序列，参与调控多种肿瘤的发生发展[14]。推测苯甲酰芍药苷可能通过调控miR-506-3p 介导NF-κB 炎症信号。进一步实验结果发现，miR-506-3p 在ALI 中表达下调，而苯甲酰芍药苷能够明显上调miR-506-3p 的表达，同时利用miR-506-3p inhibitor 能有效逆转苯甲酰芍药苷对炎症因子TNF-α、IL-6 水平的抑制作用。

总之，苯甲酰芍药苷通过减少炎症因子TNF-α、IL-6 的产生，对LPS 诱导的小鼠ALI 具有保护作用。苯甲酰芍药苷的抗炎机制可能涉及促进miR-506-3p 的表达，抑制IKKβ/NF-κB 途径。因此，苯甲酰芍药苷可能是ALI 的潜在治疗药物。后续全面研究验证将推进苯甲酰芍药苷进入临床应用。

表5 miR-506-3p 抑制剂对苯甲酰芍药苷调控TNF-α、IL-6 mRNA 的影响（）

表5 miR-506-3p 抑制剂对苯甲酰芍药苷调控TNF-α、IL-6 mRNA 的影响（）

注：TNF-α 为肿瘤坏死因子α；IL-6 为白介素-6；ALI 为急性肺损伤；与空白对照组比较，aP＜0.05；与ALI 组比较，bP＜0.05；与苯甲酰芍药苷组比较，cP＜0.05