丹皮酚对牙龈卟啉单胞菌体外抗菌性的研究Δ

沈 涛，徐远志，彭 前，周 蓉，刘海霞，祁胜财，从少华

(1.南京医科大学口腔医学院，江苏 南京210029；2.昆山市第一人民医院口腔科，江苏 昆山 215300；3.同济大学附属上海市第十人民医院口腔科，上海 200011；4.上海健康医学院附属嘉定区中心医院口腔科，上海 200011)

牙周炎属于口腔科临床较为常见的疾病，主要是由口腔致病微生物导致的以牙周组织损害为主要表现的感染性疾病。厌氧菌为该病主要致病微生物之一，若不予以及时有效的治疗，随着病情的不断进展可能促进牙周袋形成、牙槽骨吸收甚至牙齿松动，病情严重患者甚至可能出现牙齿脱落，对患者的身心健康均造成不利影响[1-2]。由此可见，有效控制牙周致病菌，恢复口腔正常菌群生态环境是治疗牙周炎的关键所在。目前认为牙龈卟啉单胞菌是慢性牙周炎最重要的致病菌之一，且与患者病情加重和治疗后复发密切相关[3-4]。寻找安全性高、能够高效清除牙龈卟啉单胞菌的药物，对慢性牙周炎的治疗至关重要。丹皮酚属于毛茛科植物牡丹根皮和萝科植物徐长卿干燥根或全草的主要有效成分，其具有镇静、催眠、解热、镇痛、抗炎和抗菌等药理作用[5-6]。本研究探讨了丹皮酚对牙龈卟啉单胞菌的抗菌效果，以期为临床治疗慢性牙周炎提供更多的药物选择。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

牙龈卟啉单胞菌购自同济大学的口腔医学院。牛心脑浸琼脂型培养基(brain heart infusion，BHI；美国Difco公司)；胰蛋白酶大豆肉汤(Tryptic Soy Broth，TSB；碧迪医疗器械有限公司)；丹皮酚(美国Sigma公司)；死/活菌型荧光染色试剂(货号：LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits 7012；美国Molecular Probes 公司)。DY-2型厌氧培养箱(浙江义乌冷冻机总厂)；BioTek酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)。氯己定(上海优培诺生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备：取冻存在-80 ℃冰箱中的纯种牙龈卟啉单胞菌放置在25 ℃室温下解冻，取30 μl接种在3 ml已经过灭菌处理的新鲜TSB液体培养基内培养。培养条件如下，温度37 ℃，二氧化碳浓度10%，培养时间18 h，约OD600=0.08～0.09，相应的菌液浓度为3.2×106cfu/ml，即得标准菌液。

1.2.2 直接接触法：取100 μl的标准菌液和含有不同浓度丹皮酚的新鲜培养基混合，配制成浓度为0、1.5、3、7.5、15及20 mmol/L的混合液，记作丹皮酚组。同法配制含1%氯己定的混合液记作阳性对照组。将不含丹皮酚以及菌液的TSB新鲜培养基作为空白对照组。分别将上述三组混合液接种在96孔板中，每孔100 μl，每组分别设置5个复孔，放置在厌氧培养箱中进行培养。培养条件如下，温度37 ℃，二氧化碳浓度10%，每隔30 min于酶标仪下完成每孔吸光值的读取，并完成统计分析。

1.2.3 菌落形成计数法：根据上述方式将牙龈卟啉单胞菌进行分组后，放置在厌氧培养箱中进行培养。培养条件如下，温度37 ℃，二氧化碳浓度10%，培养时间为4 h。分别吸取三组混合溶液100 μl，与含有丹皮酚的新鲜培养基均匀混合后配制成终浓度为0、3、7.5、15和20 mmol/L的均匀混合液为丹皮酚组；阳性对照组为含1%氯己定的混合液，共培养1 h，稀释100万倍后接种于BHI 琼脂培养基平板上，每组3个复孔。37 ℃厌氧培养箱内培养24 h，观察计算细菌菌落数并拍照，进行统计分析。

1.2.4 活死细菌染色：滴加3.2×106cfu/ml的牙龈卟啉单胞菌悬液300 μl到细胞爬片上，于37 ℃的厌氧条件下静置60 min后，顺着24孔板侧壁加入TSB培养液2 ml。再次置于厌氧培养箱内进行培养24 h，使其产生牙龈卟啉单胞菌的生物膜。随后用移液枪将培养基小心吸出，再以PBS缓冲液重复洗涤3次，分别加入含有丹皮酚终浓度为0、1.5、3、7.5、15及20 mmol/L的新鲜培养基2 ml。各组分别培养30 min后，将药液吸净，以PBS轻轻洗涤盖玻片3次，于避光条件下滴加活死细菌荧光染色剂200 μl。经避光静置孵育约15 min，并用PBS缓冲液对其实施重复洗涤3次，而后封片。放在激光共聚焦的显微镜下仔细观察拍照菌斑生物膜情况，其中死菌染色显示红色，活菌染色显示绿色。

1.3 观察指标

对比各组直接接触法结果、菌落形成计数法结果及各组活死细菌染色结果。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组直接接触法结果比较

丹皮酚浓度为1.5、3、7.5及15 mmol/L时，牙龈卟啉单胞菌的OD600显著降低，并且表现为浓度依赖性，见图1。

图1 OD(600 nm)曲线图

2.2 各组菌落形成计数法结果比较

丹皮酚浓度为3、7.5、15及20 mmol/L时，对牙龈卟啉单胞菌均有一定的抗菌结果，随着丹皮酚浓度的升高，其抗菌效果增强，且各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2—3。

图2 平板克隆图

图3 定量分析图

2.3 各组细菌的染色结果比较

不同浓度的丹皮酚(3、7.5、15及20 mmol/L)处理牙龈卟啉单胞菌生物膜后，发现空白对照组以绿色荧光为主，红色荧光不明显；丹皮酚组及阳性对照组以红色荧光为主，绿色荧光较弱，提示在丹皮酚组以及阳性对照组死菌数量占主导，说明丹皮酚针对牙龈卟啉单胞菌的生物膜存在较好的杀灭作用，且随着丹皮酚浓度从3～15 mmol/L逐渐升高，对牙龈卟啉单胞菌生物膜的杀灭作用越强，各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)；而15、20 mmol/L的丹皮酚对牙龈卟啉单胞菌生物膜的杀灭作用相似，差异无统计学意义(P>0.05)，见图4—5。

图4 CLSM扫描显微镜图

图5 活死细菌染色定量分析图

3 讨论

慢性牙周病的临床表现通常包含牙龈出血、牙周袋产生、牙槽骨吸收和进行性的附着丧失等[7-8]。随着近年来人们生活方式的不断改变，慢性牙周病的发病率正呈逐年升高趋势，且发病年龄开始趋于年轻化，其中35～44岁人群慢性牙周病的发病率高达97.20%[9-10]。由此可知，加强对慢性牙周病的发生、发展机制的研究，有利于早期防控，从而降低其发病率。目前，临床上关于慢性牙周病发病机制的研究主要集中在食物嵌塞、内分泌异常、全身性疾病及口腔解剖结构等方面。针对上述发病机制制定预防干预措施，虽可有效降低慢性牙周炎的发病风险，但效果并不十分理想。随着相关研究的日益深入，越来越多学者发现多种致病微生物可能在牙周病的发生、发展过程中起着至关重要的作用。而牙龈卟啉单胞菌被公认为是牙周毒性较强的一类致病菌，其可合成并分泌出大量毒力因子，进而介导患者牙周炎的形成、发展及针对牙周组织的损害[11-12]。因此，探寻一类可较好抑制该病原菌的药物十分必要，亦是当前牙科医师所共同关注的研究热点。

本研究结果发现，丹皮酚的浓度为1.5、3、7.5及15 mmol/L时可对牙龈卟啉单胞菌产生较强的抗菌性，且呈现出浓度的依赖性。同时，活死细菌染色法的结果表明，丹皮酚在浓度含量为3、7.5、15及20 mmol/L时，牙龈卟啉单胞菌的生物膜活菌百分比明显降低，这在陈筑等[13]的研究结果中得以佐证，提示了丹皮酚对牙龈卟啉单胞菌具有良好的体外抗菌效果。此外，牙龈卟啉单胞菌能有效地激活宿主的自身免疫细胞及巨噬细胞，进而诱导炎症有关基因的自主转录，加速促炎因子的形成及分泌，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1及白细胞介素6等，促使炎症反应发生，发挥显著的细胞毒性以及组织损伤性[14-16]。同时，牙龈卟啉单胞菌会引起牙周结缔组织的损伤以及牙槽骨吸收。在正常的机体生理状态之下，牙槽骨自身的骨改建是终身动态平衡的一个重塑的过程，其通常由成骨/破骨细胞调控的相关骨形成及骨吸收完成。慢性牙周病的主要临床特征是牙槽骨吸收，这也表明了大量破骨细胞得以形成，并使骨吸收较骨形成更快，从而促进了牙槽骨的不断吸收。因此，有效地控制机体内巨噬细胞的相关炎症反应也是抑制患者牙周组织损坏的关键。丹皮酚具有较好的免疫调节及抗炎作用，其能通过下调机体内TNF-α诱导的有关血管内皮的细胞炎症因子的自我表达，继而抑制内皮细胞的炎症反应[17]。此外，丹皮酚还能对脂多糖诱导的心形胶质类细胞炎症因子的合成分泌产生有效抑制，并通过对核因子κB的受体活化因子有关配体诱导的破骨细胞产生抑制作用，从而达到保护牙周组织的目的。这充分说明了将丹皮酚用于慢性牙周病，具有极大的潜在价值。

综上所述，丹皮酚对牙龈卟啉单胞菌具有较佳的体外抗菌效果，可将其作为治疗慢性牙周炎的药物成分之一，临床应用前景良好。