4种含中药原粉的医院中药制剂微生物限度检查方法的建立Δ

龚 亚，李 敏，曹 健，张 蓉

(陆军军医大学第二附属医院药剂科，重庆 400037)

中药制剂是由多味药材组成的复方制剂，其中很多单味药材具有清热解毒、消肿止痛作用，即可能具有抑菌活性，药品中污染的微生物生长可能被抑制，则会影响试验结果的可靠性，因此,对有抑菌作用的中药制剂做微生物限度检查时，必须采用适当的方法，消除抑菌活性后，微生物限度检查结果才能反映出药品的真实污染情况[1-4]。延芍胃康胶囊具有疏肝理气、缓急止痛的功效；乳灵片可清热解毒、软坚散结、消肿止痛；痔可平胶囊可补气、消炎、止痛及止血；延肾胶囊具有活血化瘀、利水渗湿的功效。上述4种中药制剂所含中药材中，如延芍胃康胶囊中的甘草，乳灵片中的炙甘草[5]，痔可平胶囊中的黄芪[6-7]、大黄[8-10]、蒲公英[10-13]和山银花[14]，延肾胶囊中的黄芪[6-7]、大黄[8-10]、三七[15-16]和川芎[17]等，均具有不同程度的消炎抗菌作用。因此，为判断检查方法的正确性和可行性，参考相关文献[18-23]，本研究对延芍胃康胶囊等4种含中药原粉的医院中药制剂建立了可行的微生物限度检查方法，为规范医院中药制剂的微生物限度检查方法提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

BP-Ⅱ型台式天平(上海医用激光仪器厂)；MOST-T型台式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)；LRH-70型生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；CS101-2ABN型电热鼓风干燥箱(重庆康诚永生实验设备有限公司)；BSC-1000-Ⅱ-A2型生物安全柜(苏州市华宇净化设备有限公司)。

1.2 菌种

金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、乙型副伤寒沙门菌[CMCC(B)50094]由中国食品药品检定研究院菌种保藏中心提供，均为1代冷冻保存菌株；黑曲霉[CMCC(F)98003]由三生制药科技提供，为4代冷冻保存菌株。

1.3 培养基

胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基、RV沙门菌增菌液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基、肠道菌增菌液体培养基及紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基，均由北京陆桥生物技术有限责任公司提供。

1.4 药品

延芍胃康胶囊(批号：171225、181009及190509)、乳灵片(批号：171010、180124及180912)、痔可平胶囊(批号：171009)、延肾胶囊(批号：180807、190116及190726)，均由陆军军医大学第二附属医院药剂科生产。

2 方法

2.1 菌液的制备

根据《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)通则1105和1106，用稀释液(0.9%无菌氯化钠注射液，下同)制备适宜浓度的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大肠埃希菌及乙型副伤寒沙门菌菌悬液，备用。取购买的黑曲霉冻干粉1支，按说明书方法制成适宜浓度的菌悬液，备用。

2.2 供试液的制备

取样品10 g，用稀释液溶解并逐级稀释，制成1∶10n(g/v)供试液，作为需氧菌、霉菌和酵母菌、大肠埃希菌检查的供试液，备用。

2.3 需氧菌计数方法回收率的测定

2.3.1 试验组：取供试液10 ml，各5份，分别加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌悬液0.1 ml，使每1 ml供试液含菌量≤100 cfu，混匀后取1 ml，根据《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)通则1105培养。

2.3.2 菌液对照组：以稀释液代替供试液，同试验组操作。

2.3.3 供试品对照组：以稀释液代替菌悬液，同试验组操作，测定供试品本底菌数。另作阴性、空白对照。

2.3.4 回收率计算：回收率=(试验组菌数-供试品对照组菌数)/菌液对照组菌数。《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)规定，各试验菌株的回收率范围为0.5～2.0。

2.4 霉菌和酵母菌计数方法回收率的测定

2.4.1 试验组：取供试液10 ml，各2份，分别加入白色念珠菌和黑曲霉菌悬液0.1 ml，使每1 ml供试液含菌量≤100 cfu，混匀后取1 ml，根据《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)通则1105培养。

2.4.2 菌液对照组：以稀释液代替供试液，同试验组操作。

2.4.3 供试品对照组：以稀释液代替菌悬液，同试验组操作，测定供试品本底菌数。另作阴性、空白对照。

2.4.4 回收率计算：同“2.3.4”项。

2.5 控制菌检查的方法验证

2.5.1 大肠埃希菌：(1)试验组：取1∶101供试液10 ml，及≤100 cfu的大肠埃希菌，接种至100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，根据《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)通则1106培养。(2)供试品对照组：以稀释液代替菌悬液，同试验组操作。(3)阳性对照组：以稀释液代替供试液，同试验组操作。(4)阴性对照组：以稀释液代替供试液和菌液，同试验组操作。

2.5.2 沙门菌：(1)试验组：取供试品10 g，加胰酪大豆胨液体培养基溶解并稀释制成100 ml的1∶10(g/v)供试液，加入≤100 cfu的乙型副伤寒沙门菌，混匀，根据《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)通则1106培养。(2)供试品对照组：以稀释液代替菌悬液，同试验组操作。(3)阳性对照组：以稀释液代替供试液，同试验组操作。(4)阴性对照组：以稀释液代替供试液和菌悬液，同试验组操作。

2.5.3 耐胆盐革兰阴性菌：(1)试验组：取供试品10 g，加胰酪大豆胨液体培养基溶解并稀释制成100 ml的1∶10(g/v)供试液，平行制备2份，分别加入≤100 cfu的大肠埃希菌或铜绿假单胞菌，混匀，22.5 ℃预培养2 h。取0.1 ml预培养物，分别接种至100 ml肠道菌增菌液体培养基中，根据《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)通则1106培养。(2)供试品对照组：以稀释液代替菌悬液，同试验组操作。(3)阳性对照组：以稀释液代替供试液，同试验组操作。(4)阴性对照组：以稀释液代替供试液和菌悬液，同试验组操作。

3 结果

采用平皿法测定4种含中药原粉的医院中药制剂各稀释级对各试验菌株回收率结果见表1；控制菌采用直接接种法验证中，试验组和阳性对照组均检出相应的阳性菌菌种，其余组别未检出，方法成立，见表2。

表1 需氧菌、霉菌和酵母菌各试验菌株的回收率(n=2)

表2 控制菌检查的适用性试验结果

试验结果表明，除延肾胶囊以1∶102、痔可平胶囊以1∶104进行需氧菌计数检查，痔可平胶囊以1∶102进行霉菌和酵母菌计数检查外，其余均以1∶101稀释级进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数检查，可行。经验证，大肠埃希菌、沙门菌检查中胰酪大豆胨液体培养基和耐胆盐革兰阴性菌检查中肠道菌增菌液体培养基的验证体积均为100 ml时，采用直接接种法，可行。

4 讨论

中药制剂微生物限度较宽，根据《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)通则1107，本研究在对延芍胃康胶囊等4种含中药原粉的医院中药制剂进行微生物限度检查法建立和验证的过程中，采用简便有效的稀释法进行验证，最低可以1∶104稀释级进行需氧菌验证、1∶102稀释级进行霉菌和酵母菌的有效验证。鉴于中药制剂样品中大量不溶性颗粒的存在，微生物限度检查中采用平皿法和培养基稀释法较为适宜。中药制剂样品稀释液中普遍含有大量的不溶性颗粒，在这种情况下，为避免与菌落混淆，可做样品稀释液的对照组，即将稀释液与培养基混合后，不经培养，置4 ℃环境放置，在计数时用于对照[24]。

《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)通则1107指出，含中药原粉的中药制剂,其耐胆盐革兰阴性菌应<102cfu/g，结合通则1106“耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数(N)”表，在微生物限度检查中，取用相当于0.01 g供试品量，即可判定供试品中耐胆盐革兰阴性菌是否<102cfu/g。

验证结果显示，其中部分样品的1∶101供试液(延芍胃康胶囊、延肾胶囊和乳灵片的7种菌，痔可平胶囊的黑曲霉)的菌落回收率均在0.5～2.0范围内。但是，有的批次供试品本身含菌数较多，影响结果的判断，且《中华人民共和国药典》中规定需氧菌总数测定宜选取平均菌落数<300 cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数<100 cfu的稀释级作为菌落报告的依据，因此，在供试品微生物限度检查中，为避免重复试验影响进程，建议对可行的每个稀释级进行试验，选取符合要求的结果进行报告。