杜鹃红山茶实时定量PCR内参基因筛选及验证

刘小飞，于 波，黄丽丽，孙映波

（广东省农业科学院环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室/农业农村部华南都市农业重点实验室，广东 广州 510640）

【研究意义】杜鹃红山茶（Camellia azalea）为山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）常绿灌木或小乔木，自然分布于广东省阳春市鹅凰嶂自然保护区，为广东省重点保护野生植物。杜鹃红山茶花期长，在适宜条件下可四季开花［1］，为山茶属植物的园林应用打开了广阔前景。目前，国内外关于杜鹃红山茶的研究主要集中在濒危原因及保护、生物学特性及新品种选育等方面［2］，而分子生物学水平上的相关研究较少，仅有少量关于其叶绿体基因组方面的研究［3］，基因功能方面的相关研究少见，而筛选杜鹃红山茶适用的qRT-PCR内参基因可为杜鹃红山茶基因功能研究提供理论基础和技术保障。【前人研究进展】在基因功能挖掘的过程中，基因表达模式是分析基因在物种中所起作用的重要方法之一。实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是目前基因表达分析的主要方法之一，要确保其结果的可靠性与准确性，需要选择研究条件下适用的内参基因或组合基因来检测目的基因的相对表达量，以提高结果的可靠性。转录延伸因子的编码基因（EF1α）［4-5］、α-tubulin（TUA）［6］、β-tubulin（TUB）［4］、Ubiquitin（UBQ）［7］、肌动蛋白（Actin）［8-10］和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）［8］等看家基因常被用作各物种筛选内参基因的候选基因。研究发现，在不同条件下，内参基因的表达量也会发生变化，例如火龙果在不同的胁迫条件下与不同组织中的适用内参基因不同［5］，拟南芥在二倍体和四倍体中所用的内参基因数目有差异［11］，类似的情况也存在于柠条锦鸡儿［12］和白桦［13］中。因此，正确选择、使用内参基因对基因功能的研究显得尤为重要。这方面的研究在杜鹃红山茶中尚未见报道。【本研究切入点】选择EF1α、TUA、TUB、UBQ、Actin和GAPDH等6个看家基因作为候选内参基因，通过不同的计算程序GeNorm和NormFinder评估这些看家基因在杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣中的稳定性。【拟解决的关键问题】筛选出适用于杜鹃红山茶不同组织和不同时期花瓣qRT-PCR分析的内参基因。利用筛选出的适用于不同条件下的内参基因，分析目的基因CaGASA3的表达模式，验证在杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣中最佳内参基因的可靠性，以期为进一步研究杜鹃红山茶的关键功能基因提供技术保障和理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试样品来源于生长健壮的杜鹃红山茶树（栽种于广东省农业科学院环境园艺研究所茶花资源圃内，N23°23'、E113°23'），树龄5年，树高3 m，冠幅1 m，直径3.5 cm。取幼根（YR）、成熟根（MR）、幼叶（YL）、成熟叶（ML）、4期花瓣（PS4）和5期花瓣（PS5）用于筛选不同器官适用的qRT-PCR分析的内参基因，3次重复；选取花蕾长度分别为0.5 cm（S1）、1.0 cm（S2）、1.5 cm（S3）以及4期花瓣（S4）和5期花瓣（S5）用于筛选花发育不同时期适用的qRT-PCR分析的内参基因，3次重复。用液氮速冻，-80℃保存备用。

主要试剂仪器设备：UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒（B511321，生工生物工程股份有限公司），荧光定量PCR仪（StepOne Puls型，美国ABI公司），凝胶成像仪（FR-980A，上海复日科技有限公司），台式高速离心机（TD5AWS，湖南湘仪实验仪器开发有限公司），电泳仪（DYY-6C，北京六一仪器厂），电泳槽（DYCP-32B，北京六一仪器厂），微型旋涡混合仪（WH-3，上海沪西分析仪器厂有限公司），数显恒温水浴锅（HS-800D，太仓市科教器材厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取和cDNA合成 总RNA提取采用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒（B511321），具体操作参照说明书。400 ng RNA用于cDNA第一链合成，方法参照文献［9, 14］稍作改动。所得cDNA -20 ℃保存备用。

1.2.2 内参基因的选择和引物设计 参考已有的研究报道［4-10］，在杜鹃红山茶转录组结果（中国国家生物信息中心登录号：CRX165336）中筛选出6个差异不显著的看家基因作为候选内参基因，分别为EF1α、TUA、TUB、UBQ、Actin和GAPDH。引物通过NCBI-blast设计，所用参数为：扩增序列长度为100～250 bp，引物长度为18～25个碱基，GC含量45%～55%，Tm值为60（± 3）℃。各内参基因的引物信息见表1，由生工生物工程股份有限公司合成引物。

1.2.3 qRT-PCR反应条件 利用LightCycler480II型荧光定量PCR仪进行qRT-PCR反应，采用20 μL反应体系，其中2X SG Fast qPCR Master Mix（B639271, BBI, Roche）10 μL、ddH2O 7.2 μL、10 ng/μL cDNA 2 μL、上游引物（10 μmol/L）和下游引物（10 μmol/L）分别为0.4 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，45 个循环。每个反应3次重复。

表1 6个候选内参基因的引物信息Table 1 Primer information of 6 candidate reference genes

1.2.4 引物特异性鉴定及扩增效率计算 通过1.5%琼脂糖凝胶电泳的方法对PCR扩增的产物进行分析，分析反应熔解曲线图，判断所设计引物的特异性。将所有cDNA原液等量混合后稀释，设置5个浓度梯度，分别为cDNA原液的100、10-1、10-2、10-3、10-4倍，测定qRT-PCR的标准曲线。程序运行完成后计算线性相关系数（R2）和扩增效率（E）。

1.2.5 内参基因稳定性验证及CaGASA3基因表达模式分析 以综合排名稳定的2个内参基因来校准杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣中CaGASA3的表达量，验证所筛选的内参基因的表达稳定性。CaGASA3基因qRT-PCR扩增所用的引物为：上游引物5'CTTTCACCACCTGGGTTTGG3'，下游引物5'CTCACTGAAGGCCGTGGTAAA3'。

1.2.6 数据分析与内参基因的确认 试验数据采用Excel和OriginPro 9.1进行整理，利用GeNorm［15］和NormFinder［16］评估6个候选内参基因在杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣中的表达稳定性，依据评估结果对各候选基因进行排序，筛选出两组样品中适用的内参基因。最适内参基因数目的确定可以利用GeNorm计算配对变异值（Pairwise Variation Value）来实现。当Vn/n+1＞0.15时，应当选择n+1个内参基因作进一步校正，若Vn/n+1＜0.15，则无需引入n+1个内参基因进行校正，n个内参基因已达到准确校正目的基因表达量的要求。

2 结果与分析

2.1 总RNA质量及引物特异性

以杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣为材料提取总RNA，经过平板电泳检测发现，28S和18S条带清晰（图1），OD260/280介于1.86～2.03之间，表明获得的总RNA质量较好，可用于后续试验分析。

图1 杜鹃红山茶不同器官（A）和不同时期花瓣（B）总RNA琼脂糖凝胶电泳结果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from different organs（A）and petals of different stages（B）of Camellia azalea

2.2 引物扩增特异性分析和扩增效率

PCR扩增产物经平板电泳检测，结果（图2）显示，产物大小介于132～227 bp之间，符合设计预期，产物单一且无杂带，表明所设计引物的特异性较好；同时，利用所选的6个候选内参基因引物，分别对杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣的5个浓度梯度（10倍稀释）的cDNA模板进行qRT-PCR扩增，根据所得数据绘制对应的标准曲线，结果表明，6个候选内参基因的相关系数R2＞0.9927（表2），表明cDNA模板量与对应的Ct值有较好的线性关系，满足qRT-PCR要求。同时，6个候选内参基因在两组样品中的熔解曲线均为单峰（图3），且重复性好，可用于不同器官和不同时期花瓣中的后续试验。

图2 6个候选内参基因的引物扩增特异性Fig. 2 Primer amplication specificity of 6 candidate reference genes

表2 qRT-PCR中6个候选内参基因的引物扩增效率和反应标准曲线的相关系数Table 2 Primer amplification efficiency of 6 candidate reference genes in qRT-PCR and the correlation coefficient of the reaction standard curve

2.3 候选内参基因表达丰度分析

对6个候选内参基因在不同器官和不同时期花瓣中的Ct值进行汇总，通过OriginPro 9.1软件预测候选内参基因转录丰度，Ct值越小，表达丰度越高。由图4A可知，在杜鹃红山茶不同器官中，所有候选内参基因的Ct值介于17～24之间，表明表达比较适中。GAPDH和EF1α的Ct值最低，分别处于17.85～21.73和19.32～23.04之间，表明这2个基因转录丰度最高。而TUA和TUB的Ct值最高，分别介于23.97～27.57和22.60～28.17之间，表明其转录丰度较低。由图4B可知，在杜鹃红山茶不同发育时期的花瓣中，所有候选内参基因的Ct值均介于17～22之间，表明表达较适中。GAPDH的Ct值最低，介于17.60～19.48之间，表明该基因转录丰度最高。而TUA的Ct值最高，介于23.65～26.11之间，表明其转录丰度较低。

2.4 候选内参基因表达稳定性分析

利用2个软件分别评估6个候选内参基因在杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣中的表达稳定性。

2.4.1 GeNorm分析 GeNorm算法是根据所有候选内参基因的成对变异值来计算各基因的表达稳定值M的，M值越小表明基因稳定性越好，M＜1.5的候选内参基因才可作内参基因使用。GeNorm评估结果表明，6个候选内参基因的M值均小于1.5，表现出较高的稳定性。在不同器官中候选内参基因的M值大小排序为：TUB＞EF1α＞Actin＞UBQ＞TUA＞GAPDH（图5A），其中以GAPDH和TUA基因的稳定性最好。在不同时期的花瓣中候选内参基因的M值大小排序为：TUA＞EF1α＞Actin＞GAPDH＞TUB＞UBQ（图5B），其中以UBQ和TUB的稳定性最好。

利用GeNorm计算杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣中的配对变异值，结果（图6）表明，不同器官中V2/3值为0.148，不同时期花瓣中V2/3值为0.107，二者均小于0.15，因此，本试验所选的两组样品中最适内参基因数目均为2个。

图3 6个候选内参基因在杜鹃红山茶不同器官（A）和不同时期花瓣（B）中的熔解曲线Fig. 3 Melting curves of 6 candidate reference genes from different organs（A）and petals of different stages（B）of Camellia azalea

2.4.2 NormFinder分析 NormFinder算法是基于方差分析对候选内参基因稳定性进行排序，并引入不同样品组间表达差异。与GeNorm类似，候选内参基因的表达稳定值M越小，表达越稳定。结果表明，在不同的器官中，6个候选内参基因按照M值由高到低排列依次为：TUB＞EF1α＞UBQ＞Actin＞TUA＞GAPDH（图7A），表明GAPDH最稳定，其次为TUA和Actin。在不同时期的花瓣中，6个候选内参基因按照M值由高到低排列依次为：EF1α＞TUA＞Actin＞GAPDH＞UBQ＞TUB（图7B），表明TUB最稳定，其次为UBQ和GAPDH。

2.5 内参基因稳定性的验证

为了进一步验证筛选到的内参基因的稳定性，选择不同器官中稳定性最好的内参基因（TUA和GAPDH）和不同时期花瓣中稳定性最好的内参基因（TUB和UBQ），校准CaGASA3基因的表达模式。结果（图8）表明，在不同器官中，分别以TUA、GAPDH和TUA+GAPDH为内参时，CaGASA3的表达模式趋势一致，CaGASA3基因在杜鹃红山茶的地上部分表达均较高；不同时期花瓣中，分别以UBQ、TUB和UBQ+TUB为内参时，CaGASA3在花瓣发育的不同时期表达模式趋势相同，均在S4期表达量达到最高。通过CaGASA3基因的表达模式分析，进一步证明了TUA和GAPDH为不同器官中适用的内参基因，TUB和UBQ为不同时期花瓣中适用的内参基因。

图4 6个候选内参基因在杜鹃红山茶不同器官（A）和不同时期花瓣（B）中的Ct值Fig. 4 Ct values of 6 candidate reference genes in different organs（A）and petals of different periods（B）of Camellia azalea

图5 GeNorm分析内参基因表达稳定性Fig. 5 Gene expression stability of the candidate reference genes calculated by GeNorm

图6 GeNorm分析最佳内参基因数目Fig. 6 Number of optimal reference genes calculated by GeNorm

图7 NormFinder分析内参基因表达稳定性Fig. 7 Expression stability of the candidate reference genes calculated by NormFinder

图8 CaGASA3在杜鹃红山茶不同器官（A）和不同时期花瓣（B）中的表达模式分析Fig. 8 Expression analysis of CaGASA3 in different organs（A）and petals of different periods（B）of Camellia azalea

3 讨论

qRT-PCR技术是目前最常用的基因功能分析方法，应用qRT-PCR检测基因功能的前提是筛选出合适的内参基因［17-26］。GeNorm［15］和NormFinder［16］是qRT-PCR内参筛选中两种常用的评估程序，已在多种植物中广泛应用。利用这些方法，Dai等［4］筛选出不同胁迫条件下适用于桑树的内参基因；Saddhe等［8］筛选出不同盐胁迫条件下适用于红树的内参基因；Da Silva等［7］筛选出适用于甘薯不同组织中的内参基因；Nong等［5］筛选出适用于不同胁迫条件下火龙果中的最佳内参基因。通常，看家基因在不同组织器官中具有稳定的表达水平，但它们的转录水平在不同条件下会有相应变化［6,27］。因此，筛选出适用于不同研究目的的内参基因非常重要。

本研究选择了6种看家基因作为候选内参基因，通过GeNorm和NormFinder评估了6个候选基因表达的稳定性，并利用CaGASA3基因的表达模式验证了所选内参基因的可靠性，最终得出在杜鹃红山茶不同器官中的最佳内参基因为TUA和GAPDH，在杜鹃红山茶不同时期花瓣中的最适内参基因为TUB和UBQ。内参基因 α-Tubulin（TUA）编码的 α 微管蛋白是细胞骨架的基础成分，在进化上具有较高的保守性，在许多物种中均能稳定表达［20］。GAPDH是糖酵解、糖异生及光合作用碳循环过程中的关键酶，在红球姜21和彩色马蹄莲［19］中均表达稳定。TUB2编码的β-微管蛋白在桑树［4］中表达稳定。UBQ可在红球姜［21］、黄杜鹃［22］和火龙果［5］等植物中表达稳定。本研究结果表明，在杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣中的最适内参基因是不同的。鉴于不同的环境条件，如非生物胁迫和生物胁迫都会影响内参基因表达的稳定性，今后将对杜鹃红山茶的不同胁迫条件下内参基因的表达稳定性作进一步研究。

4 结论

本研究通过GeNorm和NormFinder对杜鹃红山茶中6个候选qRT-PCR内参基因的稳定性进行评估。由GeNorm程序评估得到不同器官中6个基因的稳定性排名为：GAPDH＞TUA＞UBQ＞Actin＞EF1α＞TUB，不同时期花瓣中6个基因的稳定性排名为：UBQ＞TUB＞GAPDH＞Actin＞EF1α＞TUA；由NormFinder程序评估得到不同器官中6个基因的稳定性排名为：GAPDH＞TUA＞Actin＞UBQ＞EF1α＞TUB，不同时期花瓣中6个基因的稳定性排名为：TUB＞UBQ＞GAPDH＞Actin＞TUA＞EF1α。利用GeNorm计算配对变异值表明，不同器官和不同时期花瓣中最适内参基因数目均为2个，因此，杜鹃红山茶不同器官中最适内参基因为TUA和GAPDH，而不同时期花瓣中最适内参基因为TUB和UBQ。