紧跟世界科技发展前沿，水稻分子育种初见成效——广东省农业科学院水稻分子育种进展

刘 斌

（广东省农业科学院水稻研究所/广东省水稻育种新技术重点实验室，广东 广州 510640）

水稻是我国超过60%人口的主粮，对我国粮食安全具有举足轻重的作用。我国有14亿人口，为世界之最。人口在不断增加，可耕地面积却逐渐减少，加上全球气候变化的影响，要大幅度提高水稻单位面积产量才能确保我国的粮食安全。另外，随着我国工业和经济的高速发展，人们对水稻品质、营养、安全以及生态环境提出了更高的要求。研究表明，水稻的产量、品质、抗逆、营养等重要性状为多基因控制的复杂性状，以表型鉴定和选择为基础的水稻常规育种方法很难进行有效育种。只有在分子水平上深入了解这些复杂性状的分子遗传基础，并开展高效准确的分子育种，水稻高产、优质、抗性育种才能取得突破。近20多年来，随着分子标记技术的发展、特别是基因组测序技术、基因芯片技术、SNP检测技术等高效的基因组技术的发展，在水稻等主要作物重要性状相关基因的鉴定已取得了显著成绩，分子标记辅助选择和转基因育种也取得了令人鼓舞的成果［1-6］。这些研究结果进一步证明水稻分子育种是实现水稻育种第三次突破和确保我国粮食安全的根本途径。为提升广东水稻育种的技术水平，为广东粮食安全提供强有力的技术支撑，1992年广东省农业科学院水稻研究所（简称水稻所）申请获得了广东省第一批、农业第一个广东省重点实验室：广东省水稻细胞工程重点实验室（后更名为广东省水稻育种新技术重点实验室），以省重点实验室为依托，水稻所成立了以博士、硕士等青年科技骨干组成的研究小组，开展水稻生物技术应用研究。2007年专门成立了水稻分子育种研究室。针对水稻育种中存在的重大关键问题，开展相关基因的标记定位、克隆和分子育种研究。20多年来，水稻所紧跟世界生物技术发展前沿，充分利用丰富多样的水稻种质资源和常规育种的优势，在水稻重要性状相关基因的鉴定方面取得显著成绩，水稻分子育种初见成效。本文总结了1992年以来水稻所水稻分子育种的主要进展。

1 建立条件优良的水稻分子育种技术平台

1992年水稻所申请获得了广东省重点实验室：广东省水稻细胞工程重点实验室（后更名为广东省水稻育种新技术重点实验室），成为广东省第一批4个省重点实验室之一。随后，又申请获得了国家水稻改良广州分中心，仪器设备条件得到了进一步的补充和完善。并逐步建立了高效的分子标记技术、全基因组选择技术、遗传转化技术、基因编辑技术、全基因组关联分析技术和生物信息学等高效的基因组技术和平台。1990年代初与国际水稻研究所合作开展水稻分子标记技术应用研究，是国内最早开展水稻分子标记技术应用研究的单位之一。利用这些技术平台对水稻一些重要复杂性状，如稻瘟病持久抗性、水稻耐冷性等进行了系统的分子遗传分析，标记鉴定出超过300个QTL，对超过20个基因进行了克隆和功能研究，通过分子标记辅助选择与常规育种技术结合育成超过60个通过审定的水稻优良品种（品系），推广面积超过40万hm2，是国内分子育种成效最显著的单位之一。

2 标记鉴定出一批水稻重要性状相关基因

2.1 水稻稻瘟病持久抗性相关基因鉴定和分子机制研究

水稻稻瘟病是最具毁灭性的水稻病害，水稻稻瘟病抗性周期短是一个普遍而突出的问题。由于对水稻稻瘟病持久抗性分子遗传机制不清楚，水稻稻瘟病持久抗性育种一直未能取得突破。为了突破水稻稻瘟病持久抗性分子育种的技术瓶颈，在水稻病理学家、广东省农业科学院前院长伍尚忠研究员的组织协调下，水稻所刘斌研究团队、植物保护研究所朱小源研究团队和国际水稻研究所（IRRI）首席科学家Hei Leung教授研究团队组成国际合作研究团队，在国家自然科学基金委-国际水稻研究所联合基金项目（2项）、科技部国际科技合作重大项目、973计划前期研究项目、国家自然科学基金（3项）、广东省自然科学基金重点项目等资助下，应用分子标记技术分别对广东稻瘟病病源群体结构及“三黄占2号稻瘟病持久抗性”进行了系统的分子遗传分析。这也是当时国际上第一个以持久抗病性为题，针对一个地区从病原菌和寄主所进行的系统的分子遗传研究。

通过对广东不同生态稻区主栽品种收集的300多个稻瘟病菌DNA指纹分析获得了广东省稻瘟病菌群体结构（图1A），明确了“宗谱2（GDL2）”为广东稻瘟病菌的优势宗谱，为广东省稻瘟病抗性品种布局以及抗性鉴定代表菌株的选择提供了科学依据。根据大部分病菌归属“宗谱2”这一事实并结合主栽品种系谱分析揭示了广东省主栽品种具有密切同源宗亲关系，提出引入新的抗源、开展多样化育种是解决广东水稻品种稻瘟病抗性周期短的根本途径［7-12］。

通过广泛接种和不同生态区病圃田间抗性鉴定明晰了三黄占2号的稻瘟病持久抗性是由广谱的质量抗性和高水平的数量抗性组成。其数量抗性具有非小种专化性，对其稳定、持久的稻瘟病抗性起重要作用。标记定位出与三黄占2号稻瘟病质量抗性相关的主效基因Pi-GD-1（t）、Pi-GD-2（t）和Pi-GD-3（t），与其高水平数量抗病性相关的5个QTL［13-17］（图1B）。这些研究结果阐明了三黄占2号稻瘟病持久抗性的分子遗传基础，为水稻稻瘟病持久抗性分子育种的开展奠定了基础。

图1 应用分子标记技术进行广东稻瘟病病害系统分子遗传分析Fig. 1 Application of molecular marker technology for analysis of rice blast pathosystem in Guangdong

为进一步鉴定三黄占2号稻瘟病数量抗性相关基因，与美国Kansas州立大学Leach教授和国际水稻所Hei Leung教授合作，以防卫基因进行稻瘟病数量抗性分析［15,18-29］。研究结果表明，按防卫基因标记基因型聚类，可以把重组自交系划分为数量抗性高和低两个组。特别是，重要防卫基因几丁质酶基因、14-3-3蛋白基因、Dehydrin 蛋白基因、草酸氧化酶类蛋白基因（GLP）、致病性相关基因（PR-1）与稻瘟病数量抗性QTL共定位，并在国际上第一次提出防卫基因可能参与植物数量抗病性。通过基因芯片技术、RNA测序以及转基因遗传转化研究确认了14-3-3蛋白和GLP蛋白两个基因家族多个成员稻瘟病抗性的功能并研究了其抗病性调控机制（图2）。研究结果已分别在国际著名 期 刊Plant Physiology、Molecular Plant-microbe Interactions、Plant Molecular Biology、BMC PlantBiology发表。

在基因标记鉴定基础上，以鉴定的3个主效抗性基因紧密连锁的分子标记和相关防卫基因辅助选择育成具有稳定稻瘟病抗性的优良品系BC10和BC116（图3）。以BC10为恢复系育成抗病、优质、高产的优良杂交稻组合粤杂763通过了广东省品种审定。

以上述部分研究结果申报的科技成果“水稻稻瘟病持久抗性分子遗传机制研究及多基因抗病种质构建”获得2006年广东省科学技术奖一等奖，“水稻稻瘟病持久抗性基因鉴定和应用”获2006年全国发明展览会金奖。

2.2 水稻不同生育期耐冷性基因鉴定和多生育期耐冷新种质的创制

图2 GF14b具有调控水稻稻瘟病抗性的功能并受WRKY71调控Fig. 2 GF14b functions as a regulator in rice blast resistance and is regulated by WRKY71

图3 分子标记辅助选择获得稳定稻瘟病抗性的优良品系Fig. 3 Promising lines with stable blast resistance obtained through marker-assisted selection

水稻低温冷害是水稻生产中的世界性难题，在水稻不同的生长期均有发生。研究表明，水稻的耐冷性是一个多基因控制的复杂性状。我们对来自11个国家的多样性种质不同生育期的耐冷性的评价结果表明，水稻不同生育期的耐冷性不同［30-32］。研究表明，水稻不同生育期的耐冷性受多个基因控制，而且不同生育期控制的基因不同。因此，应用常规育种方法很难培育不同生育期耐冷的水稻品种。根据这些研究结果，我们提出了鉴定不同生育期耐冷基因，并通过基因聚合育种才能从根本上解决水稻低温冷害问题。依照这个策略，我们从2004年开始开展水稻不同生育期耐冷基因的鉴定，并通过分子标记辅助选择基因聚合创制水稻多生育期耐冷种质，得到了科技部国际科技合作重大项目、国家自然科学基金（4项）和广东省科技计划重大项目等的资助。通过10多年的努力，研究已取得了显著进展。

通过广泛的种质资源评价，已筛选鉴定出一批不同生育期强耐冷的水稻种质资源。以这些材料发展的重组自交系群体和单片段代换系的QTL分析以及多样性水稻种质的全基因组关联分析已分别标记鉴定出发芽期、芽期、苗期、抽穗开花期水稻耐冷QTL超过50个［33-34］（图4）。进一步以高效的遗传基因组学技术与QTL分析结合分别对效应大、稳定表达的发芽期耐冷QTLqLTG_sRDP2-10a、苗期耐冷QTLqCTS-9和抽穗开花期耐冷QTLqCTH-6进行候选基因分析、基因克隆和功能研究［35-36］（图5）。通过不同低温处理水稻苗期表型分析以及基因芯片和RNA测序为基础的全基因组表达分析，发现水稻苗期不同低温存在不同的冷害表型和低温响应机制［37-39］。在不同生育期耐冷基因标记鉴定基础上，选择效应较大、能稳定表达的QTL用于基因聚合育种。通过杂交、自交、分子标记辅助选择基因聚合获得带有不同生育期耐冷基因的优良品系。获得的多基因聚合系在田间试验中在不同生育期均表现出稳定的耐冷性［34］（图6），为分子标记辅助选择耐冷基因聚合解决水稻不同生育期低温冷害问题提供了第一个成功的例子。研究结果已分别在国际著名期刊Plant Biotechnology Journal、Rice、The Crop Joural、Phsiologia Plantarum、Molecular Breeding、Euphytica发表。

图4 利用不同遗传材料和方法标记鉴定的部分水稻耐冷QTLFig. 4 Partial cold tolerant QTL identified by using different genetic materials and methods

A：水稻发芽期耐冷性全基因组关联分析；B：利用重组自交系鉴定出3个稳定表达的苗期耐冷QTL；C：利用单片段代换系鉴定出的抽穗开发期耐冷QTL

A: Genome-wide association study of cold tolerance at the germination stage of rice; B: Identification of the three stably expressed QTL for cold tolerance at the seedling stage by using recombinant inbred lines; C: Identification of the QTL for cold tolerance at the heading stage by using single segment substitution lines CT（IRRI）: 国际水稻研究所冷水处理试验的耐冷性鉴定，以叶色变化为指标；SP（IRRI）: 国际水稻研究所冷水处理试验，以成活率为指标；CT（GDRRI）:在广东省农科院水稻所人工气候箱低温处理试验，以叶卷曲度为指标；SP（GDRRI）: 在广东省农科院水稻所人工气候箱低温处理试验，以成活率为指标CT（IRRI）: Cold water treatment experiment at International Rice Research Institute with leaf color change as indicator ; SP（IRRI）: Cold water treatment experiment at International Rice Research Institute with seedling survival as indicator ; CT（GDRRI）: Cold treatment in artificial climate chamber in Rice Research Institute in Guangdong with leaf crimpness as indicator; SP（GDRRI）: Cold treatment in artificial climate chamber in Rice Research Institute in Guangdong with seedling survival as indicator

图5 水稻低温发芽期耐冷QTL qLTG_sRDP2-10a和苗期耐冷QTL qCTS-9的克隆Fig. 5 Cloning of QTL qLTG_sRDP2-10a and QTL qCTS-9 for cold tolerance at the germination and seedling stages

图6 聚合芽期和苗期耐冷基因的聚合系在田间耐冷性表现Fig. 6 The lines with pyramided cold tolerant QTLs at the bud stage and seedling stage exhibited strong cold tolerance in the field

2.3 对粤香占高收获指数分子遗传分析

籼稻品种粤香占是水稻所育成的大面积推广的优良品种，研究表明，该品种的高产性归咎于其极高的收获指数（0.61）。在广东省自然科学基金重点项目的资助下，以粤香占与低收获指数品种杂交构建的重组自交系为材料，对粤香占收获指数进行了系统的分子遗传剖析，标记定位了5个与其高收获指数相关的QTL，其中位于第8染色体的QTLqHI-8在两年的试验中均能检测到，其表型贡献率分别为42.8%和44.5%。利用重组自交系该QTL区间的剩余杂合体产生的近等基因系对qHI-8的存在及其在染色体的准确位置进行了确认（图7）。这些研究结果已在国际著名期刊Rice［40-41］发表。研究结果促进了对粤香占高收获指数分子遗传基础的深入了解，特别是其效应极大的主效QTLqHI-8的鉴定为下一步高收获指数为基础的水稻高产分子育种创造了良好的条件。

2.4 通过全基因组关联分析大规模挖掘水稻重要性状相关基因

近年来，随着新一代测序技术、基因芯片技术、SNP检测技术等高效基因分型技术的高速发展，催生了全基因组关联分析技术，为在种质资源中高效鉴定重要性状相关基因提供强大工具。为在水稻种质资源中大规模挖掘水稻重要性状特异优良基因，以突破水稻分子育种的技术瓶颈，我们于2013年起对水稻所地方稻和栽培稻的320份核心种质进行重测序，并引进了来自96个国家和地区、已知70万SNP标记基因型的2 000份国际稻种。以这两套材料为基础，开展了水稻高产、优质、抗病、抗逆、直播等30多个重要性状的全基因组关联分析，标记鉴定出与这些重要性状相关QTL超过300个［42-43］（图8）。其中，鉴定出一批新的、有重要育种应用价值的QTL，为水稻分子育种的广泛开展以及基因克隆和功能研究提供了丰富的基因资源。

3 水稻分子育种取得了显著成效

利用水稻所标记鉴定的重要性状相关基因和已报道有重要育种应用价值的基因及标记辅助选择与常规育种方法结合已育成了一批优良的杂交稻亲本（表1）。

利用分子标记辅助选择培育的不育系和恢复系进行组合配制，自主和合作育成吉丰优1002、吉优华占、聚两优751、安丰优5618、安丰优华占、聚两优750、金稻优618、荃优466、五优466、广泰优华占、五优618、博Ⅲ优466、长泰优298、五乡优晶占、五乡优398等杂交稻新组合60余个，在南方稻区得到大面积应用，累计推广面积在40万hm2以上。

图7 粤香占收获指数分子遗传分析Fig. 7 Genetic analysis of harvest index in Yuexiangzhan

4 水稻分子育种展望

经过近30年发展，水稻所已组建了一个初具规模、以博士为主要骨干的水稻分子育种研究队伍，已构建了分子标记技术、转基因技术、全基因组选择技术、全基因组关联分析技术、基因编辑技术和生物信息学等为主要技术的高效的水稻功能基因组学和分子育种技术平台，水稻重要性状基因的鉴定已取得了显著成绩，水稻分子育种初见成效。我们将以这些研究为基础，进一步开展以下研究：

表1 分子标记辅助选择育成的部分不育系和恢复系Table 1 Some sterile lines and restorer lines bred through marker-assisted selection

4.1 围绕水稻产业转型升级进一步开展相关基因的挖掘

有重大育种应用价值基因的缺乏仍然是水稻分子育种广泛开展的技术瓶颈。在水稻分子育种的未来研究中，我们仍然把优异基因的挖掘作为核心内容。将以水稻所丰富的水稻种质资源和引进的多样性丰富的国际稻种资源为材料，为了准确鉴定出多样性种质资源所有有利的遗传变异，将构建高覆盖度的泛基因组［44］，结合全基因组关联分析和多组学研究对水稻重要性状相关基因大规模精确鉴定，特别是对当前水稻产业发展十分重视的优质、高产、绿色、高效、适应机械化操作等性状进行重点研究，挖掘和精确鉴定有重大育种应用价值的基因，为水稻产业转型升级提供强有力技术支撑。

4.2 创制带有特异优良基因、遗传背景优良的新种质

许多优良的基因存在于一些农艺性状较差的种质中，难以为育种家所直接应用，使得这些基因未能在水稻育种中应用。为了解决这一突出问题，我们将以现代品种核心种质与多样性种质为材料进行全基因组关联分析，一方面鉴定现代品种重要性状相关基因；另一方面鉴定现代品种不存在的特异优良基因，并把这些基因通过回交、分子标记辅助选择导入到遗传背景优良的品种中，创制水稻育种新种质，使鉴定到的优异基因能为水稻育种家所直接应用。此外，在水稻重要性状功能基因组研究的基础上，针对已知功能基因进行基因编辑，对水稻进行定向改良，创制新种质。

4.3 建立水稻分子育种核心数据库

建立水稻所核心种质包括重要性状表型、序列信息、重要性状基因型、多组学数据等信息的数据库，为水稻功能基因鉴定和高效的水稻分子设计育种提供重要的信息。

4.4 加强水稻分子育种应用研究

在大规模基因标记定位的基础上，对有重大育种应用价值的基因（QTL）精确定位和克隆，分析主效QTL单倍体型和等位基因变异，研发高效选择的功能标记，充分利用水稻所在水稻常规育种成效和优势，通过分子标记辅助选择、基因编辑等技术与常规育种方法结合开展高效准确的分子育种，使水稻所水稻育种继续走在全国的前列。