作物青枯病研究进展

佘小漫，何自福

（广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室，广东 广州 510640）

茄科雷尔氏菌〔Ralstonia solanacearum（Smith）Yabuuchi〕，也称为茄科劳尔氏菌、茄科茄科青枯菌（简称青枯菌），属薄壁菌门β-变形菌纲雷尔氏菌属（Ralstonia），为革兰氏阴性、好氧棒状杆菌。该病原菌由Smith（1896）最先鉴定，并定名为茄青枯假单胞菌（Pseudomonas solanacearum,E.F.Smith, www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy）。1992年，Yabuuchi等［1］根 据 DNA-DNA、DNA-RNA分子杂交，以同源性分析为基础将其归入伯赫氏属，命名为青枯伯克霍尔德菌（Burkholderia solanacearum）；随后通过对16S rRNA基因组序列测定和聚类分析，Yabuuchi等又建议成立一个新属——雷尔氏属（Ralstonia），将青枯伯克霍尔德菌、皮克特伯克霍尔德菌（Burkholderia pickettii）和Alcaligenes euterophus列入此属［2］。

该病原菌侵染引起的植物细菌性青枯病是热带、亚热带和温带地区最重要、最具破坏性的植物细菌病害之一，被认为是一种毁灭性植物病害。青枯菌可通过土壤和灌溉水进行传播，遇到寄主植物后从根部侵入，进入木质部维管束，通过维管束系统迅速扩散到植物地上部组织。由青枯菌侵染引起的病害典型症状表现为木质部变褐，叶片偏向性生长以及植株萎蔫［3］。

青枯菌寄主范围广泛，可侵染50多科200多种植物［4］，主要包括番茄等茄科植物、花生等豆科植物、菊花等菊科植物以及桑树、桉树等木本植物。在我国，已报道有番茄、茄子、马铃薯、烟草、花生、南瓜、生姜、沙姜、桑、空心菜、桉树、木麻黄、芝麻、无花果、广藿香、红掌、万寿菊、甘薯等90余种作物受到茄科雷尔氏菌为害［5］。除了西藏自治区和澳门没有相关报道外，我国已经有30个省份有青枯病报道［5］，而广东、广西、福建、湖南、四川是青枯病多发、重发省份。青枯病造成的产量损失一般会超过50%，甚至绝收，是许多作物生产的重要限制因子［6］。

1 茄科雷尔氏菌多样性及基因组特征

1.1 茄科雷尔氏菌的多样性

青枯菌存在明显的生理分化。不同地理起源的青枯菌在与其寄主长期协同进化的过程中，演化出明显的生理分化或菌系多样性［7］。根据青枯菌的寄主范围差异，将其划分为5个生理小种（race）［8-10］；基于对 3种双糖和 3种己醇的氧化利用情况，可将其划分为5个生化变种（biovar）［10-13］。Cook等利用 RFLP技术将青枯菌划分为亚洲分支和美洲分支［14-15］。随后，研究者通过对青枯菌HRP簇基因指纹图谱分析、16S rRNA 基因分析［16-19］、16S-23S rDNA间隔区和内切葡聚糖酶和hrpB基因分析［17,20］，又发现了2个青枯菌分支，即非洲分支（包含来自非洲的菌株）和印尼分支（包含来自印度尼西亚的菌株）；此外，还发现了青枯菌的2个近缘种，为害丁香树的蒲桃青枯菌Ralstonia syzygii和引起香蕉血液病的BDB菌［19］。可见，青枯菌的遗传多样性十分突出。

2005年，Fegan等［21］提出了青枯菌是一个复合种概念〔R. solanacearumspecies complex（RSSC）〕，并根据16S-23S rDNA基因间隔区序列、内切葡聚糖酶egl基因和hrpB基因的分析，提出了青枯菌种下划分为演化型的新分类框架。青枯菌演化型的分类框架包括4个不同水平的分类单元：种（Species）、演化型（Phylotype）、序列变种（Sequevar）和株系（Clone），并且建立了相应的鉴定方法［21］。利用演化型特异性复合PCR青枯菌可分为4个演化型，演化型Ⅰ和Ⅱ分别对应亚洲分支和美洲分支，演化型Ⅲ包含来自非洲的菌株，演化型Ⅳ包含来自印度尼西亚菌株以及青枯菌近缘种R. syzygii和BDB菌。根据菌株egl基因序列同源性，每个演化型的菌株又分为多个不同的序列变种。目前，已经鉴定出57个序列变种［22］。可见，这种种下分类方案较好地反映出青枯菌的遗传进化与地理起源。

2011年，Remenant等［23］通过基因组分析建议将青枯菌分为3个种。2014年，Safni等［24］通过DNA-DNA杂交分析，修正了Remenant等的建议，将青枯菌分为4个种，并建议演化型Ⅰ和演化型Ⅲ的菌株为一个种，命名为Ralstonia pseudosolanacearumsp. nov.，演化型Ⅱ菌株为一个种，沿用原来R. solanacearum的种名，演化型Ⅳ菌株归入R. syzygii中。2016年，Prior等［25］结合青枯菌表型分析，基因组比对和转录组分析，支持了Remenant等的建议，将青枯菌分为3个种，演化型Ⅰ和演化型Ⅲ的青枯菌株为一个种，演化型Ⅱ的青枯菌株为一个种，演化型Ⅳ青枯菌株、R.syzygii和BDB菌为一个种。2020年，Etminani等［26］利用青枯菌57个看家基因系统发育分析进一步支持该命名观点。

1.2 茄科雷尔氏菌基因组特征

2002年，Salanoubat等完成了第一个来自番茄的青枯菌基因组测序分析［27］。青枯菌基因组包含两个复制子，即染色体和宏质粒，这两个复制子的G+C含量几乎相同。全基因组平均大小约为5.8 Mb，其中宏质粒约占全基因组的1/3［27-28］。染色体和宏质粒上均含有与致病性相关的重要基因，大部分的看家基因功能由染色体决定，而宏质粒只具有部分重要基因，富含致病岛基因和菌株特异基因［20,27-28］。青枯菌的环境适生性和致病性功能大部分由宏质粒决定，包括III型分泌系统和VI型分泌系统、鞭毛运动性相关基因、趋药性基因和胞外多糖合成基因簇均在宏质粒上［29］。青枯菌基因组除了这两个复制子之外，目前发现了青枯菌基因组还存在小质粒，如青枯菌株CMR15和Psi07分别含有35 kb和13 kb的小质粒［28］，HA4-1菌株含有2个大小分别为1 947 245 bp和143 755 bp的质粒［30］。

青枯菌是一个高异质性的细菌，一个菌株的基因组序列不能代表整个青枯菌物种。截至2020年 9月 30日，NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse#!/prokaryotes/490/）上显示，全球已有203株青枯菌被测序，其中94株青枯菌为全基因组，13株菌株仅完成染色体测序，另外有96株青枯菌的基因组组成为多个scaffold或contig状态。而完整测序的94株青枯菌菌株主要分离自番茄（41株）、马铃薯（28株）、烟草（5株）、香蕉（3株）、大焦（2株）、茄子（2株）、沙姜（2株）、花生（1株）、黄瓜（1株）、芝麻（1株）、龙葵（1株）、木麻黄（1株）和芝麻（1株），另外分离自土壤的菌株1株，未知来源的菌株4株。随着测序技术的快速发展和测序成本的逐步降低，越来越多的分离自不同寄主的青枯菌菌株全基因组被测序，这些结果将有利于揭示青枯菌的致病性和寄主特异性。

2 茄科青枯病在广东的发生与为害

广东横跨热带、亚热带地区，常年高温、多雨，植物终年生长繁殖，这些为青枯病的发生流行创造了十分有利的条件，每年由青枯菌侵染引起的作物青枯病在广东发生与危害均十分严重。广东是国内最早记录有青枯病发生的省份［6］。本团队长期调查与监测表明，在广东，青枯菌侵染引起了多种作物青枯病，除前人报道的番茄、茄子、辣椒、马铃薯、花生、烟草、姜、桑、桉树、甘薯、美人蕉、沙姜等寄主植物外，空心菜、菊花、向日葵、广藿香、胜红蓟、南瓜和人参果等作物上也发生了由茄科雷尔氏菌侵染引起的青枯病。截至目前，在广东至少有35种植物发生了茄科雷尔氏菌侵染引起的青枯病。

不同作物的青枯病为害情况不同。多年调查表明，南瓜青枯病病株率5%～12%，胜红蓟青枯病病株率3%～5%，广藿香青枯病病株率12%～21%，沙姜青枯病病株率7%～60%，生姜青枯病病株率8%～35%，番茄青枯病病株率45%～80%，茄子青枯病病株率5%～25%，辣椒青枯病病株率13%～30%，马铃薯青枯病病株率10%～25%，花生青枯病病株率7%～13%，烟草青枯病病株率10%～35%，甘薯青枯病病株率3%，空心菜青枯病病株率7%，菊花青枯病病株率10%，人参果青枯病病株率17%［31］，向日葵青枯病病株率23%和仙草青枯病病株率14%。

作物青枯病在广东的分布存在差异。番茄、茄子和辣椒青枯病在广东省的分布范围最广，番茄青枯病主要分布在11市21县（市、区、东莞市麻涌镇）、茄子青枯病主要分布在9市13县（市、区、东莞市2镇）、辣椒青枯病主要分布在7市9县（市、区、东莞市麻涌镇）；花生青枯病在阳江市阳春、广州市、梅州市兴宁和河源市等地有分布；空心菜青枯病在广州市、肇庆市、惠州市和中山市有分布；大肉姜青枯病在阳江市、惠州市和肇庆市有分布；马铃薯青枯病在惠州市、广州市及茂名市有分布；而广藿香、沙姜、南瓜、甘薯、烟草、胜红蓟、人参果、向日葵、仙草、菊花、桉树和桑树等作物青枯病只在广东特定区域发生（表1）。

3 茄科青枯菌广东种群特征分析

3.1 不同寄主来源青枯菌代表菌株生理小种鉴定

1999—2020年，本团队在广东各地共采集不同作物青枯病疑似病样1 545份，对疑似病样进行分离与鉴定，共保存19种寄主植物的青枯菌1 045株，包括番茄（267株）、茄子（113株）、辣椒（117株）、马铃薯（87株）、花生（59株）、南瓜（53株）、大肉姜（56株）、沙姜（48株）、空心菜（46株）、甘薯（18株）、烟草（32株）、胜红蓟（32株）、人参果（21株）、向日葵（30株）、仙草（18株）、广藿香（18株）、菊花（13株）、桉树（12株）和桑（5株）。

通过室内人工接种方法，利用鉴别寄主番茄、茄子、烟草、香蕉、姜、马铃薯及菌株的来源寄主植物对16种寄主来源的青枯菌代表菌株致病力进行测定，结果表明：分离自南瓜、番茄、茄子、辣椒、烟草、花生、空心菜、菊花、广藿香、桉树、甘薯等11个寄主的青枯菌菌株可侵染大多数的茄科作物，属于1号生理小种［22,32-33］；分离自马铃薯的青枯菌菌株主要侵染马铃薯，弱侵染番茄和烟草，属于3号生理小种；分离自姜、沙姜和胜红蓟的青枯菌菌株主要侵染姜，弱侵染马铃薯，番茄等其他作物，属于4号生理小种［34-35］；分离自桑树的青枯菌菌株对桑的致病力很强，但对番茄、马铃薯、茄子和辣椒的致病力很弱，属于5号生理小种。

表 1 广东省作物青枯病发生与分布Table 1 Occurrence and distribution of crop bacterial wilt in Guangdong Province

3.2 不同寄主植物来源的青枯菌生化特性分析

测定了分离自16种寄主作物110个青枯菌菌株的生化变种，结果表明， 110个菌株中，1个菌株不能利用麦芽糖、乳糖、纤维二糖、山梨醇、甘露醇和卫矛醇这六种碳水化合物，属于生化变种1；2个分离自马铃薯菌株可以利用麦芽糖、乳糖和纤维二糖，不能利用山梨醇、甘露醇和卫矛醇，属于生化变种2；55个菌株可以利用麦芽糖、乳糖、纤维二糖、山梨醇、甘露醇和卫矛醇6种碳水化合物，属于生化变种3（占50%）；52个菌株可以利用山梨醇、甘露醇和卫矛醇，不能利用麦芽糖、乳糖和纤维二糖，属于生化变种4（47.3%）。生化变种3和生化变种4是广东省青枯菌优势生化变种［36］。

3.3 广东青枯菌种群遗传多样性分析

110个代表菌株中，108个菌株属于演化型I，2个分离自马铃薯的菌株属于演化型II。110个菌株分属11个序列变种，分别为序列变种1、13、14、15、17、18、34、44、45、48 和 57，其中序列变种45是我国的首次报道，序列变种57是首次发现。序列变种15、34和44是广东省分布最广的序列变种，在广东各地均有发现；序列变种 13、14、17、45 和48只在我省粤西和中部地区发现；序列变种1和18只在我省中部地区出现；序列变种57在我省粤西地区发现；粤东和粤北地区目前只发现序列变种15、34和44。同一寄主的菌株存在多种序列变种，从番茄上分离到的青枯菌存在8个序列变种，从马铃薯上分离到的青枯菌存在6个序列变种，从沙姜上分离到的青枯菌存在5个序列变种，从茄子和辣椒上分离到的青枯菌存在4个序列变种，从南瓜和花生上分离到的青枯菌存在3个序列变种，从生姜、烟草、空心菜和广藿香上分离到的青枯菌各存在2个序列变种，而从菊花、甘薯、胜红蓟、桉树和桑上分离的青枯菌只存在1种序列变种［22,36］。这些研究结果将有助于我省作物青枯病防控策略的制定。

3.4 广东青枯菌种群致病性分化

通过接种鉴别寄主植物，对来自广东各地番茄、茄子和辣椒上的青枯菌的致病力分析，明确了广东青枯菌致病力存在明显的分化现象。根据10个鉴别寄主植物的病株率，31个青枯菌代表菌株聚类为3个组（或致病型），其中第Ⅰ组菌株主要来自种植番茄和茄子历史较长的广州、东莞菜区，其致病力较强；第Ⅱ组菌株主要分离自茄子和辣椒上，其致病力中等；第Ⅲ组菌株主要来自番茄种植时间较短的区域，其致病力也较弱。寄主植物和栽培耕作制度可能是影响青枯菌致病力分化的主要因子［37］。此外，选取10个分离自不同寄主、不同序列变种的23株青枯菌代表菌株对感病和抗病番茄品种的致病性测定，根据病株率对23株青枯菌菌株进行了系统聚类分析，结果表明：23株青枯菌菌株分为2个分支，分离自马铃薯上的属于青枯菌演化型II、序列变种1的RS413菌株对抗病番茄品种LS-89不致病，对感病番茄品种东茄致病力极弱，自成一分支；其余22株分离自番茄、茄子、烟草、辣椒、马铃薯和南瓜的演化型I的青枯菌菌株对LS-89和东茄两个番茄品种存在不同程度的致病力，聚类成一分支［24］。

3.5 广东青枯菌各分离物基因组特征

3.5.1 青枯菌广东番茄分离物RS163菌株基因组特征 分离自番茄的青枯菌存在多个致病型或序列变种。本团队完成来自番茄的4个不同序列变种的菌株测序，其中菌株RS163基因组与其他3个菌株基因组差异较大。RS163菌株基因组大小为6 298 980 bp，存在环状的染色体、宏质粒和小质粒，大小分别为3 980 373、2 095 415、223 192 bp，GC含量分别为66.69%、66.85%和61.44%。与其他青枯菌基因组相比，RS163菌株基因组远大于青枯菌基因组平均大小（5.8 M）。毒性因子基因和III型分泌系统核心基因与其他青枯菌是否存在差异正在分析中。

3.5.2 青枯菌广东沙姜分离物YC45菌株基因组特征 分离自沙姜的青枯菌属4号生理小种，本团队率先完成了沙姜分离物YC45菌株的全基因组测序。YC45菌株基因组大小为5 732 909 bp，包含了1个染色体和1个宏质粒，大小分别为3 724 487、2 008 422 bp，GC含量分别为67.193%和66.896%［38］，与其他演化型青枯菌基因组相比，YC45菌株基因组结构存在大量差异区域；毒性因子基因和Ⅲ型分泌系统核心基因存在较大差异。这些结果为进一步解析青枯菌多样性、进化、致病机理及寄主特异性等研究奠定了基础。

4 作物青枯病防控技术研究

4.1 作物品种对青枯病抗性水平的鉴定与评价

鉴定与评价广东生产上推广种植的品种抗病性水平。在对广东青枯菌种群致病性分化研究基础上，通过室内人工苗期接种鉴定方法，评价了广东生产上推广种植的番茄、茄子、花生和南瓜主要品种对青枯病的抗性水平，筛选出年丰、穗丰和益丰3个番茄品种对番茄青枯病表现为中抗（耐病）［39］；冠军紫红茄、长优紫长茄、华育二号紫红长茄、宏运茄王、长丰二号和新丰1 号紫红长茄这6 个品种对茄子青枯病表现为抗病；美丰三号紫长茄、紫龙长丰Ⅲ、福将紫红长茄、紫荣6 号长茄、中冠二号紫长茄、金卡龙三号紫红长茄、旭紫长茄、农丰紫红茄、农夫长茄、圣紫和特级32 号这11 个茄子品种对茄子青枯病表现为中抗（耐病）［40］；汕油188对花生青枯病表现为高抗，仲恺1号、仲恺花2、仲恺花3、仲恺花4、汕油523 、汕油51和汕油199对花生青枯病表现为中抗（耐病）；香芋小南瓜（广州世茂农业科技有限公司）和香蜜小南瓜（广东科农蔬菜种业有限公司）对南瓜青枯病表现为中抗（耐病）［22］。

鉴定与评价省蔬菜品种区试新品种抗病性水平。自2002年起，本团队一直承担广东省蔬菜品种区域性试验抗病性水平鉴定任务。19年来，共鉴定与评价了59个番茄品种、57个茄子品种、81个辣椒品种、119个花生品种和19个马铃薯品种的抗病性水平，其中番茄、茄子、辣椒、花生和马铃薯抗青枯病品种所占比例分别为8.47%、14.04%、3.7%、1.68%和0，耐病品种比例分别为10.17%、47.37%、34.57%、47.9%和15.79%，而感病品种比例分别为81.36%、38.59%、61.73%、50.42和84.21%。可见，参加广东省蔬菜品种区试的这5类作物新品种中，除了茄子品种外，其余4种作物的大部分品种不抗病，导致这种现状的主要原因：一是抗性育种资源缺乏；二是广东省青枯菌种群结构复杂，不同寄主的青枯菌可侵染多种作物。

4.2 茄科作物抗青枯病育种研究

广东省农业科学院植物保护研究所与亚洲蔬菜研究发展中心积极合作，开展抗病、优质种质资源的引进与创新利用研究，对收集的835份番茄材料与自交系、309份茄子材料［41］、29份辣椒资源进行了抗病性鉴定，筛选出高抗青枯病番茄材料9份、抗病材料27份，高抗青枯病茄子材料7份、抗病材料33份，高抗青枯病辣椒材料2份、抗病材料20份。配合广东省农业科学院蔬菜研究所和农业科研试验示范场以及广州市农业科学研究院开展番茄、茄子和辣椒等抗青枯病资源筛选与新品种选育，先后创制出抗病番茄品种益丰、益丰2号、阿克斯一号、粤科达301［42］等，抗病茄子品种紫荣4号、紫荣6号、玫瑰紫花茄、丰宝紫红茄、翡翠绿2号［43］等，以及抗病辣椒品种辣优2号、辣优6号、辣优9号、辣优15号、辣优13号［44］等新品种。这些新品种在广东、广西及海南等华南地区得到推广应用，为控制青枯病的流行和保障作物安全生产发挥了重要作用。

4.3 作物青枯病防控技术的集成与示范

我们根据广东省茄科青枯菌的特性及青枯病的发生流行动态，因地制宜地开展了茄科青枯病防控技术集成示范。提出了“防病栽培为基础，抗病品种利用为中心，药剂防控为辅”的作物青枯病防控策略，技术措施包括：选择种植抗病优质的品种或嫁接苗，不同类型的抗病品种轮植，用无病新土培育健康壮苗，大田增施有机肥或使用微生物菌肥为基肥和施入适量的石灰以改良土壤，及时清除病株，在移栽前以及移栽后灌根多粘类芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌等药剂。

在过去的十多年中，本团队先后在在广州市增城区、南沙区开展了番茄青枯病控制技术集成示范；在清远市连州、佛山市高明区、惠州市惠东县和茂名市高州开展了茄子青枯病控制技术集成示范；在茂名市高州、佛山市高明区、湛江市遂溪县和徐闻县、惠州市惠东县、广州市花都区进行辣椒青枯病控制技术集成示范；在广州市增城区进行马铃薯青枯病控制技术集成示范；在广东省沙姜主产区阳江市阳春进行沙姜瘟控制技术集成示范等。这些技术集成示范均取得了较好成效，为茄科青枯病的防控技术推广应用积累了经验。

5 问题与展望

茄科雷尔氏菌是一个复合种，其种群内多样性十分突出。这种多样性表现在生理生化特性、基因组组成与基因序列、对寄主植物致病性与致病力等方面显著差异，甚至包括致病机制不同。这种多样性不仅出现在不同寄主来源的菌株间，而且也出现在同一寄主来源的菌株/分离物间，这对其监测与防控尤其是抗病育种等带来了挑战。

作物青枯病是典型的土传病害，其病原青枯菌在无寄主植物时可在土壤、水体中存活长达5年以上，防控难度极大。种植抗病品种是控制该病害最有效、经济的方法，也是目前生产上应用的主要防治措施。但青枯菌种群存在丰富的多样性，长期、大面积种植某一类抗病品种，极易导致抗病品种的抗性容易丧失。为了延长抗病品种的使用年限，在监测特定区域青枯菌种群动态及致病力分化前提下，要做好作物品种抗性/抗病基因的多源化及不同抗病品种的合理布局。

药剂防控青枯病也是生产上常用的措施，目前在我国登记用于防控作物青枯病的药剂34个，有效成份主要是荧光假单胞杆菌、多粘类芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、中生菌素、三氯异氰尿酸、噻菌铜、噻森铜、噻唑锌等，这些登记药剂以防治番茄（20个）、烟草青枯病（14个）为主，其他作物如辣椒、茄子、姜等上仅登记1～2个药剂，多数作物青枯病目前还没有登记药剂，而且这些药剂在田间实际防控效果有限，远不能满足生产需要。因此，对青枯病有效的药剂尤其是免疫诱抗剂和生防菌研发将是未来重点研究方向。

人类对青枯菌的研究已有一百多年历史，人类与青枯菌的斗争仍将是一个长期的课题。由于青枯菌种群结构复杂，寄主范围广，目前对青枯菌寄主特异性机理研究较少，尤其是关于演化型I青枯菌寄主特异性机理研究尚未见报道。这提示我们应重视青枯菌侵染不同寄主机理的研究。随着更多不同寄主菌株的全基因序列测定，通过生物信息学比较分析与高通量基因功能验证技术，将有助于我们解析青枯菌寄主特异性机理。

近年来，作物青枯病的发生与危害有加重的趋势，青枯菌新寄主植物也不时出现。随着我国现代农业的快速发展，作物生产的规模化、集约化、机械化正在扩大，并将成为主要生产方式，青枯病的发生与危害风险会逐步加大。因此，要加强对茄科雷尔菌种群动态长期、系统监测，同时开展高效、持久的防控技术研发，实现对青枯病的有效控制。