P16及FHIT基因异常表达在非小细胞肺癌发病机制中的研究

佘天宇，佘真真，徐海涛，刘 帅，贾 腾，张庆广，李文晶

(1.滨州医学院附属医院 a.胸外科，b.肿瘤科，山东 滨州 256600；2.山东省无棣县人民医院普外科，山东 滨州 251900)

非小细胞肺癌(NSCLC)约占全部肺癌的85%，发病率约为45.39/10万[1]，我国NSCLC每年新发病例约73.3万，死亡病例约59.1万[2]。原癌基因和抑癌基因参与NSCLC的发生发展，多个基因异常表达，长期积累下引起正常细胞增殖调控失常，细胞恶性增殖导致肿瘤发生[3，4]。NSCLC 基因异常表达的发病机制为临床研究热点，P16及FHIT基因为NSCLC主要的抑癌基因[5]，当发生基因变异如杂合性缺失、DNA甲基化等情况，可能造成抑癌基因失活[6]。本研究分析P16及FHIT基因杂合性缺失、DNA甲基化与P16及FHIT蛋白表达缺失的关联，为NSCLC发病机制研究提供参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料2018年10月至2019年12月我院肺癌切除术NSCLC患者65例，均符合NSCLC诊断标准[7]，术后病理确诊为NSCLC。收集NSCLC肿瘤组织标本和距离癌灶组织边缘5 cm以外的正常肺组织标本。男41例，女24例，年龄47～75岁[(61.39±7.22)岁]；临床分期：Ⅰ期10例，Ⅱa期17例，Ⅱb期25例，Ⅲa期13例；病理分型：鳞癌37例，腺癌28例；有吸烟史45例。

1.2 仪器设备Taq DNA聚合酶、限制性内切酶(Takara公司)，兔抗人P16单克隆抗体、兔抗人FHIT单克隆抗体(三生制药集团)，Trizol试剂、免疫组化试剂盒(美国赛默飞世尔科技公司)。变性聚丙烯酰胺凝胶、硝酸银溶液等由实验室自行配置。主要仪器：ABI QuantStudio 7实时荧光定量PCR仪(美国赛默飞世尔科技公司)，“六一牌”电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1聚合酶链式反应(PCR) 取10 mg组织标本研磨、匀浆，加入PBS溶液200 μl，离心6 min，弃上清，再加入Trizol试剂2 ml，在室温下培育5 min。向EP管中加入0.2 ml氯仿/1 ml Trizol，室温培育3 min。离心15 min吸取上层水相，加入0.5 ml异丙醇/1 ml Trizol再离心15 min。再弃上清，沉淀加入70%乙醇清洗，离心10 min。弃上清，取管底沉淀物DNA晾干10 min，干燥DNA沉淀物待检。P16及FHIT基因的PCR引物序列、反应体系及条件见表1。扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上观察。

表1 PCR反应条件

1.3.2基因杂合性缺失检测 采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-硝酸银染色法检测。方法：取PCR扩增产物8 μl，加入等体积双链DNA变性缓冲液，97 ℃变性10 min，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。硝酸银染色法：将变性聚丙烯酞胺凝胶在双蒸水中漂洗一次，0.1%硝酸银溶液染色30 min，双蒸水中漂洗3次，加入3%碳酸钠溶液(含0.014%乙醇)显色，当DNA带较清晰时，倒掉显色液，加入7.5%冰乙酸终止。杂合性缺失判定标准：等位基因扩增信号缺失为(+)。

1.3.3DNA甲基化检测 采用限制性内切酶法处理。方法：取组织标本中提取的沉淀物DNA 3 μl，加入甲基化敏感限制性内切酶1 μl，25 ℃水浴过夜(未酶切处理的DNA为对照)。再进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。DNA甲基化判定标准[8]：经限制性内切酶处理后的DNA仍能扩增出完整的DNA片段为(+)。

1.3.4免疫组化法检测蛋白表达 组织标本常规石蜡切片4 μm制片，放入80 ℃烘箱内烤片30 min。二甲苯、无水乙醇透明、脱水。再使用蒸馏水洗，封闭液室温孵育30 min，PBS缓冲液冲洗3次。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法(SP法)。冲洗后，滴加10%非免疫羊血清封闭液，孵育30 min。加入兔抗人P16或FHIT单克隆抗体(一抗)过夜，以PBS缓冲液代替一抗为阴性对照，再加入标记有辣根过氧化物酶(HRP)的羊抗兔抗体(二抗)过夜。滴加DAB显色溶液，显微镜下观察特异性显色。免疫组化结果判定采取Bresalier半定量法，判定标准[9]：①阳性细胞评分：0分为阳性细胞<10%，1分为10%～25%阳性细胞，2分为26%～50%阳性细胞，3分为51%～75%阳性细胞，4分为≥76%阳性细胞；②显色深浅评分：0分为不显色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。两项评分相加，≥3分为蛋白表达阳性(+)，<3分为蛋白表达缺失(-)。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验；关联性分析采用列联表χ2检验，并计算列联系数c；以Logistic回归分析筛选独立影响因素。检验水准ɑ=0.05。

2 结果

2.1 两组P16基因杂合性缺失、甲基化发生率以及P16蛋白表达情况比较NSCLC组织P16基因杂合性缺失发生率为58.46%，甲基化发生率为49.23%，蛋白表达缺失率为67.69%。正常肺组织未见P16基因杂合性缺失、甲基化、蛋白表达缺失。两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组P16基因杂合性缺失、甲基化发生率以及P16蛋白表达情况比较 [n(%)]

2.2 两组FHIT基因杂合性缺失、甲基化发生率以及FHIT蛋白表达情况比较NSCLC组织FHIT基因杂合性缺失发生率为70.77%，甲基化发生率为66.15%，蛋白表达缺失率为72.31%。正常肺组织未见FHIT基因杂合性缺失、甲基化、蛋白表达缺失。两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 两组FHIT基因杂合性缺失、甲基化发生率以及FHIT蛋白表达情况比较 [n(%)]

2.3 NSCLC组织P16基因杂合性缺失、甲基化与P16蛋白表达缺失的关联性分析P16基因杂合性缺失与P16蛋白表达缺失具有关联(χ2=15.340，列联系数c=0.437，P<0.001)，见表4。P16基因甲基化与P16蛋白表达缺失具有关联(χ2=30.083，列联系数c=0.562，P<0.001)，见表5。

表4 NSCLC组织P16基因杂合性缺失与P16蛋白表达缺失的关联性分析

表5 NSCLC组织P16基因甲基化与P16蛋白表达缺失的关联性分析

2.4 NSCLC组织FHIT基因杂合性缺失、甲基化与FHIT蛋白表达缺失的关联性分析FHIT基因杂合性缺失与FHIT蛋白表达缺失具有关联(χ2=16.865，列联系数c=0.484，P<0.001)，见表6。FHIT基因甲基化与FHIT蛋白表达缺失具有关联(χ2=40.827，列联系数c=0.621，P<0.001)，见表7。

表6 NSCLC组织FHIT基因杂合性缺失与FHIT蛋白表达缺失的关联性分析

表7 NSCLC组织FHIT基因甲基化与FHIT蛋白表达缺失的关联性分析

2.5 P16、FHIT蛋白表达缺失与临床特征的影响因素分析临床分期是P16蛋白表达缺失的独立影响因素，性别、吸烟史是FHIT蛋白表达缺失的独立影响因素(P<0.05)，见表8，表9。

表8 P16蛋白表达缺失与临床特征的影响因素分析

表9 FHIT蛋白表达缺失与临床特征的影响因素分析

3 讨论

恶性肿瘤发生发展受原癌基因与抑癌基因调控，P16及FHIT基因为NSCLC主要的抑癌基因，起负调节作用，与原癌基因相互制约，抑制肺上皮细胞异常增殖。P16基因位于人类染色体9p21，直接参与细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂。大多数人类肿瘤细胞株纯存在P16基因杂合性缺失、甲基化、碱基置换突变或缺失等多种基因变异现象，可能与NSCLC易感性相关。本研究结果显示，在NSCLC组织中，P16基因杂合性缺失发生率为58.46%，甲基化发生率为49.23%，蛋白表达缺失率为67.69%，而在正常肺组织中未见P16基因杂合性缺失、甲基化、蛋白表达缺失；而且P16基因杂合性缺失与P16蛋白表达缺失具有关联。上述说明，NSCLC易发生P16基因杂合性缺失、甲基化，这与Wang等[10]、钟云华等[11]研究报道一致。而且这种基因突变造成了P16基因失活，导致P16蛋白表达缺失，丧失了P16基因的抑癌功能，肺上皮细胞周期G1期(DNA合成前期)向S期(DNA合成期)加速转变，G1期的DNA修复、RNA和核糖体准备不完善，过早的进入到S期，导致细胞恶性增殖发展为NSCLC。本研究还发现，临床分期是P16蛋白表达缺失的独立影响因素，临床分期高的患者P16蛋白表达缺失风险是临床分期低的患者的2.809倍，可以解释为：P16基因突变与临床分期升高存在相互效应，P16基因突变越多，蛋白质表达缺失也相应增多，患者越易发生细胞恶性增殖，也使得NSCLC生物学行为趋向于恶性。黄芬芬等[12]研究也证实，P16基因突变与NSCLC肿瘤分期具有相关性。

FHIT基因位于人类染色体3p14.2，目前研究发现大多数肺癌患者存在FHIT基因突变及蛋白表达缺失。本研究结果显示，在NSCLC组织中，FHIT基因杂合性缺失发生率为70.77%，甲基化发生率为66.15%，蛋白表达缺失率为72.31%，而正常肺组织未见FHIT基因杂合性缺失、甲基化、蛋白表达缺失；而且FHIT基因杂合性缺失与FHIT蛋白表达缺失具有关联。上述说明，NSCLC易发生FHIT基因杂合性缺失、甲基化，而且这种基因突变造成了FHIT基因失活，导致FHIT蛋白表达缺失。Geng等[13]研究也表示，NSCLC易发生FHIT基因甲基化。刘莹等[14]研究指出FHIT基因甲基化水平升高，NSCLC患病风险增加2.927倍，这对NSCLC具有较高的诊断价值。FHIT基因的抑癌作用尚不明确，Lee等[15]研究指出可能与诱导癌细胞凋亡有关，FHIT蛋白是一种肿瘤抑制蛋白，通过14-3-3τ诱导NSCLC细胞自噬。本研究还发现，性别、吸烟史是FHIT蛋白表达缺失的独立影响因素，男性、吸烟者的FHIT蛋白表达缺失风险是女性、不吸烟者的2.442倍、4.433倍。FHIT基因与吸烟密切相关，FHIT基因可能是烟草致癌物诱发癌变的靶基因。肺癌男性发病率通常高于女性，FHIT蛋白表达缺失率也较高，可能是因为男性患者吸烟率较高。

综上所述，P16及FHIT基因异常表达在NSCLC的发生发展中起重要作用，发病机制可能与P16及FHIT基因的杂合性缺失和甲基化导致的P16及FHIT蛋白表达缺失有关。P16及FHIT蛋白表达缺失，造成抑癌基因对细胞正常生长负调节的作用失控，导致NSCLC发生。在临床上，检测P16及FHIT基因突变情况，或许有助于NSCLC的诊断、分型及治疗，这可作为下一步的研究方向。