贮藏条件对江蓠琼胶酶活性和琼胶凝胶强度的影响

张曦文，伍 菱,2,3,4，童风景，姜泽东,2,3,4，朱艳冰,2,3,4，肖安风,2,3,4，倪 辉,2,3,4，李清彪,2,3,4

( 1.集美大学 食品与生物工程学院，福建 厦门 361021； 2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门 361021； 3.厦门南方海洋研究中心经济海藻资源化利用重点实验室，福建 厦门 361021； 4.厦门市食品生物工程技术研究中心，福建 厦门 361021 )

江蓠(Gracilaria)是大型底栖海藻，属红藻门，真红藻纲，杉藻目，江蓠科，江蓠属[1-4]，具有藻体大、适应能力强、生长快等特点[5]，在我国福建和广东沿海以及东南亚地区沿海大规模养殖，是提取琼脂(琼胶)的主要原料[6-8]。琼脂，俗称洋菜、冻粉、冻胶或寒天，是江蓠、石花菜(Gelidium)、坛紫菜(Porphyrahaitanensis)等海洋红藻的主要多糖组分，其含量占藻体干质量的20%以上[9-10]。琼胶在亚洲国家作为食材消费已有300多年[11-13]，主要由(1-3)-β-D-半乳糖和(1-4)-3,6-内醚-α-L-半乳糖等组成的线性多糖构成，溶于热水，具有良好的胶凝性和凝胶稳定性，常作为胶凝剂、稳定剂、增稠剂和乳化剂等广泛应用于食品、轻工、医药等领域[14-17]。

凝胶强度是评价琼胶品质的主要指标之一，对其应用价值具有重要的影响[18-19]，探明琼胶凝胶强度的影响因素对改善琼胶凝胶品质具有重要意义[20]。相关研究表明，提取条件对琼胶产率和凝胶强度具有较大的影响[21-25]。此外，海藻种类、季节和环境参数也显著影响琼胶的提取得率和品质。Marinho-Soriano等[26-27]发现，2种江蓠G.gracilis和G.bursa-pastoris分别在春季和夏季琼胶提取得率最高，秋季和冬季最低，而琼胶凝胶强度和凝胶温度分别在夏季和秋季最高；从G.bursa-pastoris提取的琼胶的凝胶温度和凝胶强度呈正相关。Ordua-Rojas等[28]研究发现，加利福尼亚湾2种重要海藻真江蓠(G.vermiculophylla)和Gracilariopsislongissima在夏季收获时，其琼胶产率最高，而在冬季收获时，其琼胶产率最低；夏季收获的真江蓠所提取琼胶的凝胶强度显著提高。Freile-Pelegrín[29]通过研究贮藏时间对于墨西哥尤卡坦州江蓠琼胶的产率和品质影响，发现海藻的贮藏时间显著影响其琼胶的凝胶强度、凝胶和熔化温度。同时，Freile-Pelegrín[29]还报道了在高热高湿度条件处理下，琼胶被江蓠中微生物降解，分子量降低，致使其凝胶强度显著下降，这说明海藻收获贮藏过程中琼胶酶作用对琼胶的得率和凝胶强度具有重要影响。目前，对收获后的江蓠进行贮藏已经成为琼胶生产企业保持全年稳定生产的必不可少的条件，虽然相关研究表明，江蓠贮藏过程中环境温度、湿度和贮藏时间对琼胶的提取得率和凝胶强度具有显著影响，但其琼胶酶在贮藏过程中的活性变化规律及对琼胶凝胶强度和提取得率影响尚不明确。

笔者通过模拟江蓠采收及干燥后的自然贮藏条件，探究贮藏过程中温度、湿度的变化对江蓠中琼胶酶活性、还原糖含量以及所提取琼胶产率和凝胶强度的影响，阐明江蓠琼胶酶活性受贮藏条件影响的变化规律，明确琼胶提取得率和凝胶强度与江蓠琼胶酶活性之间的内在联系，为琼胶生产企业稳定贮藏江蓠提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂材料

经自然风干的江蓠购于绿新(福建)食品有限公司，采集于福建省龙海市东海海域；琼胶粉(广东环凯科技有限公司)；3，5-二硝基水杨酸(国药集团化学试剂有限公司)；氢氧化钠和无水乙醇等试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器设备

电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]，HH-4/HH-8数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)，Epoch2T微量酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)，FE20 pH计[梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司]，冷冻离心机(BECKMAN COUNTER)，电热恒温干燥箱(上海智诚分析仪器制造有限公司)，高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 江蓠样品的制备和贮藏条件模拟

分别称取江蓠0.5 g (用于还原糖含量的测定)、1.0 g (用于提取粗琼胶酶酶液)和5.0 g (用于提取琼胶)，分为若干组，每组设置3个平行。迅速将分组后的江蓠分别密封于保鲜盒中，通过调控保鲜盒中湿度对藻体中水分含量进行调整。经含水量测定，获得约10%、14%、40%和60% 4种不同水分含量的江蓠样品。将盛装各组江蓠样品的密封保鲜盒分别置于5、15、25 ℃和35 ℃恒温培养箱中模拟贮藏温度和湿度环境。每日测定经处理后江蓠中琼胶酶活性、还原糖含量、琼胶提取得率、琼胶凝胶强度等指标，连续测定4 d、每组做3次独立重复试验。

1.3.2 江蓠中还原糖含量的测定(DNS法[30])

取0.5 g不同条件处理过的江蓠进行液氮冷冻研磨破碎细胞壁后，置于50 mL离心管，加入超纯水至10 mL刻度，45 ℃水浴浸提2 h。冷却至常温后，20 ℃下8000 r/min离心40 min, 留残渣备用。取0.2 mL的上清液，加入3，5-二硝酸水杨酸试剂(150 μL)，在沸水浴中加热10 min,取出后立即冷却至室温，以蒸馏水定容至0.5 mL，混匀，在540 nm波长下，测定吸光值，每组设置3个平行。根据葡萄糖标准曲线，计算还原糖含量。

1.3.3 江蓠中琼胶酶粗酶液的制备和琼胶酶的活性测定

1.3.3.1 琼胶酶粗酶液的制备

取1.0 g不同条件处理过的江蓠进行液氮冷冻研磨破碎胞壁后，置于50 mL离心管，加入5 mL预冷的Tris-HCl缓冲溶液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，500 mmol/L KCl 和10 mmol/L β-巯基乙醇)，混匀后，于冰浴中缓慢搅拌抽提24 h。在4 ℃下，经12 000 r/min离心20 min，弃沉淀，取上清液备用。

1.3.3.2 琼胶酶的活性测定

采用DNS法[30]对琼胶酶的活力进行测定。取100 μL酶液加入400 μL含0.5%(m/V)海藻酸钠的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，混匀后45 ℃反应20 min。加入500 μL DNS试剂，混匀后置于沸水浴5 min，冷却至室温后，于波长540 nm处测定吸光值，对照组采用灭活的酶。酶活性单位定义：在45 ℃、pH 7.5条件下，1 min产生1 μmol还原糖所需的酶量。

1.3.4 琼胶的提取[31]

取不同条件处理过的江蓠5.0 g置于250 mL烧杯中，加入7% NaOH溶液(m/V)至100 mL，91 ℃水浴浸泡2 h。加水清洗至pH<9.0后，酸化30 min(酸化液：草酸0.05 g，硫酸33 μL，EDTA 0.01 g，加水定容至200 mL)，过滤。加水清洗至pH>5.5后，用0.2%的次氯酸钠(m/V)漂白30 min。然后清洗至pH>8.0。向处理后的各组江蓠中加入100 mL纯水，100 ℃水浴抽提2 h，过滤弃去残渣。过滤后，将滤液进行冷冻干燥，得到琼胶多糖。琼胶提取得率按下式计算：

提取得率/%=m2/m1×100%

式中，m1为江蓠干质量，m2为琼胶粉末质量。

1.3.5 凝胶强度的测定

分别称取1.3.4中各组江蓠中提取的琼胶粉末0.1 g于50 mL离心管中，加蒸馏水10 mL，经沸水浴加热，溶解至澄清溶液，于60 ℃下水浴保温30 min后，封住离心管管口，于20 ℃下倒置15 h，凝固后，采用TA-XT2型质构仪测定其凝胶强度。测定方法和参数：采用D/0.5探头，选择压缩模式，测试前速度1 mm/s，测试速度1 mm/s，测试后速度5 mm/s，应变30%，触发力5 g。记录凝胶破裂时最大的力(g)，再根据探头截面积换算为凝胶强度(g/cm2)。

2 结果与分析

2.1 贮藏温度和湿度对江蓠中琼胶酶活性的影响

考察在连续贮藏4 d的过程中，不同的贮藏温度对不同含水量的江蓠中琼胶酶活性的影响。由图1a可见，琼胶酶活性的总体趋势是随着贮藏时间的增加而逐渐降低，而随着江蓠中水分含量的增加

图1 不同温度，不同贮藏时间其水分含量对琼胶酶活性影响Fig.1 Effect of moisture on agarase activity in different storage time at various temperaturesa.5 ℃; b.15 ℃; c.25 ℃; d.35 ℃.

而增加。在贮藏温度为5 ℃、江蓠水分含量为60%时，贮藏1 d后，其琼胶酶活性达到最高。由图1b可见，在贮藏温度为15 ℃时，琼胶酶活性与江蓠中水分含量呈正相关性，其随着江蓠水分含量的增加而增加。在贮藏1 d后，其琼胶酶活性最高，活性随着江蓠中水分含量下降呈下降趋势。同时，与5 ℃组结果一致，在贮藏温度为15 ℃，江蓠水分含量为60%时，贮藏1 d后，其琼胶酶活性达到最高。由图1c可见，在贮藏温度为25 ℃时，江蓠中琼胶酶活性随着水分含量的增加呈上升趋势，在贮藏第3 d后，酶活性达到最高，而后呈现下降趋势。由图1d可见，在贮藏温度为35 ℃时，连续贮藏过程中，随着时间的增加，琼胶酶活性呈下降趋势；但随着江蓠中水分含量的增加，其琼胶酶活性呈上升趋势。由以上结果可知，贮藏过程中环境温度和湿度的变化对江蓠琼胶酶活性具有重要的影响，而贮藏湿度是最关键的影响因素，江蓠琼胶酶活性随着贮藏湿度的上升呈升高趋势。

2.2 贮藏温度和湿度对江蓠中还原糖含量的影响

贮藏湿度、温度和时间对江蓠中还原糖含量的影响见图2。江蓠中水分含量与藻体中生成的还原糖含量呈正相关性，均随藻体水分含量的增加而呈上升的趋势。这与2.1部分结果较为一致，江蓠琼胶酶活性随着贮藏湿度的上升呈升高趋势，琼胶酶将藻体中琼胶降解产生还原糖，致使水分含量较高的江蓠中还原糖含量相应升高。

图2 不同温度下随着贮藏时间增加水分含量对还原糖含量的影响Fig.2 Effect of moisture content on reducing sugar content with increasing storage days at different temperaturesa.5 ℃; b.15 ℃; c.25 ℃; d.35 ℃.

2.3 贮藏温度和湿度对江蓠琼胶提取得率和凝胶强度影响

根据江蓠中琼胶酶活性的变化曲线(图1)和江蓠中还原糖含量变化曲线(图2)，在江蓠水分含量为10%和60%，贮藏1 d和2 d后，琼胶酶活性和还原糖含量变化最为明显。因此，选取该贮藏湿度，设置贮藏温度处理江蓠，并对处理后的江蓠中琼胶进行提取，测定琼胶提取得率和其凝胶强度(图3)，明确琼胶提取得率和凝胶强度与江蓠琼胶酶活性之间的内在联系。由图3可见，在贮藏1 d后，江蓠的琼胶提取得率没有随江蓠中水分含量的升高或降低呈现增加或减少的变化趋势，而在贮藏2 d后，江蓠的琼胶提取得率呈现随藻体水分含量的升高而下降的变化趋势；同时，在贮藏温度为15 ℃，湿度为10%条件下，贮藏1 d和2 d后江蓠中琼胶的提取得率均达到最高。由图4可见，所提取琼胶的凝胶强度呈现随原料湿度的升高而呈降低的趋势，在江蓠水分含量为60%的条件下提取琼胶的凝胶强度普遍低于水分含量为10%的江蓠所提取的琼胶的凝胶强度。以上结果表明，贮藏过程中环境温度和湿度的变化对江蓠所提取的琼胶的凝胶强度具有重要的影响，而贮藏湿度是最关键的影响因素，江蓠中琼胶的凝胶强度随着贮藏湿度的上升呈下降趋势。

图3 不同贮藏时间江蓠琼胶得率Fig.3 Extraction yield of agar from Gracilaria at different storage timea.1 d; b.2 d.

图4 不同贮藏时间江蓠琼胶凝胶强度Fig.4 Concentration strength of agar from macroalga Gracilaria at different storage timea.1 d; b.2 d.

3 讨 论

3.1 预处理温度和湿度对琼胶酶酶活的影响

经自然风干后的江蓠对其进行预处理，不同湿度和温度均可以影响江蓠中琼胶酶活性。酶的表面需要一定量的水分子使酶催化底物的活性中心达到一定的柔韧性的“开放”构象，刚性降低，较易与底物分子结合[32]。已有研究表明，除了海藻种类、季节和环境参数显著影响琼胶的提取得率和品质外[24-25]，海藻的贮藏时间也显著影响其所产琼胶的凝胶强度、凝胶和熔化温度[29]。目前，海藻如江蓠、龙须菜(G.lemaneiformis)等在贮藏过程中环境参数(如温度、湿度、时间等)的变化对藻体中琼胶酶活性的影响尚无报道。基于此，笔者针对原料贮藏条件对江蓠琼胶酶活性影响的变化规律进行研究，发现江蓠在贮藏过程中温度和湿度的变化对江蓠琼胶酶活性具有重要的影响，并且贮藏湿度是最关键的影响因素，其藻体中酶活性与贮藏湿度呈正相关性。这一结果为进一步研究江蓠琼胶酶活性与琼胶提取得率和凝胶强度之间的内在联系奠定研究基础。

3.2 琼胶酶酶活对琼胶凝胶强度的影响

另一方面，贮藏过程中环境参数(如温度、湿度、时间等)的变化对藻体中琼胶的提取得率和凝胶强度的影响尚无报道。本试验结果显示，江蓠的琼胶提取得率呈现随藻体水分含量的升高而下降的变化趋势，而所提取琼胶的凝胶强度随江蓠中水分含量的升高呈现降低的趋势，表明贮藏湿度也是影响琼胶的提取得率和凝胶强度最关键的因素，江蓠中琼胶的凝胶强度随贮藏湿度的上升呈下降趋势。凝胶强度是琼胶品质评价的重要指标之一。在贮藏过程中，较高的环境湿度会导致江蓠中提取的琼胶的凝胶强度明显下降。结合在不同贮藏条件下，江蓠藻体中琼胶酶活性的变化和还原糖含量变化，推测在高湿度环境下藻体中琼胶酶活性较高，会大量降解藻体中的琼胶。藻体中琼胶的降解导致所提取的琼胶的提取得率和凝胶强度显著下降[33-34]。此外，高湿度的贮藏条件下相关分解代谢酶活性提高，可有效促进海藻中琼胶的降解[32,35-36]。因此，有效抑制藻体中琼胶酶活性、减少微生物的活动和降低分解代谢酶活性是提高琼胶提取得率和品质的有效方法。通过低湿度和低温度的条件下对海藻进行贮藏可有效提高琼胶提取得率和品质。同时，在海藻原料收获后，通过高盐腌渍、干燥的方法可有效降低海藻的水分含量和减少海藻从潮湿环境吸收水，并且高盐度可有效控制微生物的活动和相关分解代谢酶活性，防止藻体中琼胶降解。

4 结 论

通过研究，明确了江蓠贮藏过程中温度和湿度对其琼胶酶活性、琼胶提取得率、琼胶凝胶强度具有重要的影响，并且发现湿度是最关键影响因素，琼胶酶活性与贮藏湿度呈正相关性，而琼胶提取得率和凝胶强度与贮藏湿度呈负相关性。此外，还发现江蓠中的琼胶酶会加速琼胶的降解，导致琼胶提取得率和凝胶强度下降。本试验为通过对江蓠进行合理贮藏而提高琼胶得率和质量提供了科学依据。