一株鹅副粘病毒的分离和鉴定

潘建波

（柳州市动物疫病预防控制中心广西柳州 545001）

鹅副粘病毒病是由鹅副粘病毒（Gooseparamyxovirus，GPMV）引起的一种以消化道病变为特征的传染病。急性病例和继发感染的患鹅死亡较多，慢性病例多引起鹅软腿无力，慢慢消瘦，缩头呆立。日龄越小，发病率和死亡率越高，传染源主要是病鹅或病愈后带毒的鹅[1]。由于鹅为群体饲养，又属水禽，一旦发生传染病就会迅速传播、污染面很广难以控制，可造成严重的经济损失。鹅副粘病毒病对鹅的危害较大，雏鹅染病后死亡率通常在90%以上，常在发病后1～2d 内死亡，成鹅一般在发病后3～5d 死亡，给养鹅业健康发展带来了巨大的影响[2,3]，该病尚无特效治疗的药物，通过控制引种、做好消毒剂、制定合理的免疫计划，可有效预防该病的流行与发生。本研究从送检的病料中成功分离鉴定一株鹅副粘病毒，为后续的鹅副粘病毒病新型疫苗的研制及流行病学调查奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

9～10 日龄SPF 鸡胚购自济南斯帕法斯家禽有限公司，一步法RT-PCR 扩增试剂盒、鹅副粘病毒阳性血清、禽流感病毒（H5 亚型）与禽流感病毒（H9 亚型）阳性血清均购置山东济南承森贸易有限公司。

1.2 病料处理

取广西柳州某发病鹅场送检的鹅，进行解剖后取病变组织，加入3～5 倍体积的灭菌的磷酸盐缓冲液研磨，冻融2 次，12,000rpm 离心10min，取上清液加入青、链霉素，4℃作用4～5h后，12,000 rpm 离心5min，取上清液经0.45μm 滤膜过滤除菌，样品-20℃保存备用。

1.3 病毒分离

将上述待样品接种9～10 日龄SPF 鸡胚，接种量为0.1mL/胚，弃去24h 内死亡鸡胚，逐日观察至120h，取鸡胚尿囊液继续接种9～10 日龄SPF 鸡胚，传至3 代。

1.4 血凝及血凝抑制试验

取收获的第3 代鸡胚尿囊液，按常规血凝试验操作方法进行分离病毒的血凝（HA）、血凝抑制试验（HI）的测定，分别用副粘病毒、禽流感病毒（H5 亚型）、禽流感病毒（H9 亚型）阳性血清对分离病毒进行血凝抑制测定。

1.5 RT-PCR 鉴定

根据文献，设计合成引物F1：5'-GCCGAATTCCCGAATCATCACGACGCTTAA-3'；F2：5'-GTGAAGCTTGAGTCTGTGAGTCGTAC-3'[4]。

采用一步法RT-PCR 扩增方法对待分离病毒样品进行RT-PCR鉴定。PCR 反应程序设置为：50℃15min；94℃30s，退火温度为55℃45s，72℃下延伸时间为45s，30 个循环；72℃5min，PCR 产物经凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 病毒分离

处理后的组织样品尿囊腔接种于9～10 日龄SPF 鸡胚，至第2 代开始出现规律性死亡，死亡时间在接种后48～60h 之间。收获第3 代含毒鸡胚尿囊液于-70℃保存备用。

2.2 HA、HI 测定结果

按常规方法对收集的第3 代尿囊液毒进行了鸡红细胞血凝测定，血凝效价为1:512；进一步实验表明，该毒株的血凝效价可以被副粘病毒阳性血清所抑制，而与H5 亚型禽流感病毒、H9 亚型禽流感病毒阳性血清不发生抑制反应。

2.3 RT-PCR 鉴定结果

扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶核酸电泳检测，在位于约970bp处可见特异性目的DNA 扩增条带（图1），阴性对照未有任何扩增，与文献的报道一致。

3 讨论

近年来，随着我国鹅的饲养数量和生产规模不断扩大，鹅副粘病毒病早已成为严重危害养鹅业的重要疾病之一，国内已有众多学者对病原体进行了分离鉴定及一系列相关研究，张伟等[5]于2010 年从梁山县一养鹅场病死鹅中分离出一株疑似鹅副粘病毒，通过血凝抑制实验及PCR 鉴定最终确定为鹅副粘病毒，命名为LS-1，并对其致病性进行了相关研究；黄宇翔等[6]于2018 年从疑似鹅副粘病毒感染致死的鹅肝脏和脾脏中成功分离到了一株鹅副粘病毒；杜宗沛等[7]于2013 年从江苏泰州市某鹅场分离到一株高致病性鹅副粘病毒，其分离株经灭活处理后免疫鹅群，取到了良好的免疫效果。本文成功分离鉴定了一株鹅副粘病毒，为发病鹅场查明了致病原因，为养鹅场第一时间制定出综合防治措施提供了依据，同时为鹅副粘病毒病新型疫苗的研究及流行病学调查提供了技术支持。尽管该养殖场已经免疫过疫苗，但很可能因为饲养密度过大、环境条件差等一系列原因导致免疫失败，可见疫病的成功防控需要综合考虑到各个细节。█

图1 分离毒RT-PCR 电泳检测